Nous présentons une technique pour l'étiquetage des neurones simples dans le système nerveux central (SNC) de<em> Drosophila</em> Embryons, ce qui permet l'analyse de la morphologie neuronale soit par lumière transmise ou microscopie confocale.
Dans cet article, nous décrivons comment étiqueter individuellement les neurones dans le SNC embryonnaire de Drosophila melanogaster par injection juxtacellulaire de la membrane lipophile Dil marqueur fluorescent. Cette méthode permet la visualisation de la morphologie des cellules neuronales dans les moindres détails. Il est possible de marquer n'importe quelle cellule du système nerveux central: les corps cellulaires des neurones cibles sont visualisés sous une optique DIC ou par expression d'un marqueur fluorescent génétique comme la GFP. Après marquage, le DiI peut être transformée en une tache brune permanente par photoconversion pour permettre la visualisation de la morphologie des cellules avec de la lumière transmise et de l'optique DIC. Alternativement, les cellules Dil-marqués peuvent être observés directement par microscopie confocale, permettant génétiquement introduits protéines rapporteurs fluorescents à colocalised. Cette technique peut être utilisée dans n'importe quel animal, quelle que soit le génotype, ce qui permet d'analyser les phénotypes mutants à résolution cellule unique.
La connaissance de la morphologie neuronale au niveau des cellules individuelles est une condition essentielle pour la compréhension de la connectivité neuronale et la fonction du système nerveux central. Ainsi, dès les premiers jours de la neuroscience, les chercheurs ont cherché à développer des simples techniques de marquage de cellules (voir 7 pour un traitement historique de cette question). Les méthodes classiques comme la coloration de Golgi fournir une excellente résolution de la morphologie neuronale, mais ne sont pas adaptés si l'on cherche à identifier un type particulier de neurone d'une manière dirigée, que la coloration se produit de façon aléatoire. Le développement de méthodes pour la coloration des cellules individuelles par injection intracellulaire ou juxtacellulaire de colorants à partir d'une microélectrode l'exigence en matière d'étiquetage spécifique.
L'application de neurone unique colorant injection chez la drosophile a présenté un défi majeur, en raison de la petite taille de l'organisme et à la fois ses neurones. Néanmoins, la coloration seul neurone de Drosophila embryonnaire </em> Neurones a été atteint au milieu des années 1980 dans le laboratoire de Corey Goodman 15. Bien que la méthode a été éminemment utile et a fourni des renseignements clés sur les mécanismes de développement neuronal chez la drosophile au cours des 20-30 dernières années (par exemple, 2, 10), de nombreux travailleurs ont renoncé en grande partie à cause de ses exigences techniques.
La disponibilité de ces dernières années des techniques génétiques pour l'étiquetage des neurones chez la drosophile a également contribué à l'impopularité de l'injection de colorant unique neurone. Expression GAL4-dirigé des constructions GFP membrane ciblées peuvent fournir une excellente résolution de la morphologie des neurones 1, 20. Cependant, cette méthode présente certaines limites: l'expression souvent inévitable de la GFP dans les cellules multiples peuvent obscurcir la structure des neurones individuels et une ligne pilote de GAL4 peut ne pas être disponible pour conduire l'expression dans un neurone d'intérêt particulier. Le MarcM (Analyse mosaïque avec un représentantmarqueur des cellules ressible) Méthode 8 peut fournir l'étiquetage des neurones essentiellement tout au niveau de la cellule individuelle, mais ne peut pas être utilisé avec succès dans l'embryon et la larve au début à cause de la rotation lente de la protéine GAL80.
Compte tenu de ces limites de l'étiquetage génétique, nous croyons que l'injection de colorant seul neurone dans l'embryon de drosophile reste une technique intéressante et mérite une plus large application. Pour promouvoir cet objectif, nous proposons ici une description détaillée de la méthode. Une illustration de sa puissance est fournie par notre récent compte de la morphologie de l'ensemble des interneurones dans neuromeres abdominale de l'embryon chez la drosophile fin 14. Cette étude, qui révèle à la fois la variabilité morphologique des différents types de cellules neuronales et les principes d'organisation neuromere dans le SNC de l'embryon, n'aurait pas été possible avec n'importe quelle méthode d'étiquetage actuellement disponible autres.
Un avantage majeur de la drosophile comme modèle de système est qu'il permet l'analyse du développement et de la fonction au niveau des cellules individuelles. Ceci est particulièrement utile en ce qui concerne le système nerveux, où la diversité des types de cellules est exceptionnellement élevé et la fonction et la morphologie des cellules voisines peut être totalement différente.
Procédé nous présentons ici permet le marquage des neurones individuels avec un…
The authors have nothing to disclose.
Ce travail a été soutenu par une subvention de la DFG avec l'heure GMT
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
REAGENTS | |||
DAB | Sigma-Aldrich | D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
DiI | Invitrogen/Molecular Probes | D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
Glycerol | Roth | 3783 | 70% in PBS |
Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
PBS | 1x | ||
TRIS | Roth | 4855 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
EQUIPMENT | |||
Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
DC – amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
Coverslips | Menzel | BB018018A1 | 18 x 18 mm |
Coverslips | Menzel | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
Flat Capillaries | Hilgenberg | outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
Object Slides | Marienfeld Superior | 1000000 | |
Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1.