の中枢神経系における単一細胞のラベリング<em>キイロショウジョウバエ</em
Summary
我々は、中枢神経系における単一ニューロンを標識するための技術（CNS）の提示<em>ショウジョウバエ</em>透過光または共焦点顕微鏡法のいずれかによる神経形態の分析を可能にする胚。
Abstract
この記事では、我々は個々に親油性の蛍光膜マーカーDiIのjuxtacellular注射によるキイロショウジョウバエの胚中枢神経系の神経細胞をラベル付けする方法を説明します。この方法は、非常に詳細に神経細胞形態の可視化を可能にします。それは、CNS内の任意のセルにラベルを付けることが可能です：標的ニューロンの細胞体は、DIC光学の下やGFPなどの蛍光遺伝子マーカーの発現によって可視化されています。標識後、DIIは、透過光とDIC光学系と細胞形態の可視化を可能にすることにより光電永久茶色の染色に変換することができます。あるいは、DiI標識細胞を遺伝子導入した蛍光レポータータンパク質がcolocalisedすることを可能にする、共焦点顕微鏡で直接観察することができます。技術はそれが可能な単一細胞の解像度で変異体の表現型を解析すること、遺伝子型にかかわらず、任意の動物に使用することができます。
Introduction
個々の細胞レベルでの神経形態の知識は神経接続とCNS機能を理解するための重要な前提条件です。このように、神経科学の黎明期から、研究者は、単一細胞標識技術（この問題の歴史的な治療のために7を参照）を開発しようとしてきた。そのようなゴルジ染色などの古典的な方法は、神経形態の優れた解像度を提供しますが、一つは染色はランダムに発生するように、指示された方法で、神経細胞の特定の種類にラベルを付けるために求める場合は適していません。微小電極から色素の細胞内またはjuxtacellular注射することで、単一細胞を染色するための方法の開発は、特定のラベリングの要件に対処した。
ショウジョウバエへの単一ニューロン染料注入のアプリケーションが原因生物とニューロンの両方のサイズが小さい、大きな課題を提示した。 ショウジョウバエの胚のそれにもかかわらず、単一のニューロンの染色</em>ニューロンはコーリー·グッドマン15の研究室では、1980年代半ばに達成された。方法は極めて有用であったし、最後の20〜30年（ 例えば、2、10）以上、ショウジョウバエの神経発達のメカニズムにいくつかの重要な洞察を提供してきましたが、多くの労働者が主な理由として、その技術的な要求のために、それを敬遠してきた。
ショウジョウバエのニューロンの標識のための遺伝的技術のより近年の可用性は、単一ニューロンの色素注入の不人気に貢献してきました。膜標的化GFPコンストラクトのGAL4指向発現は、神経形態学1、20の優れた分解能を提供することができます。しかし、この方法は、一定の制限があります：複数の細胞におけるGFPのしばしば不可避式は個々のニューロンの構造を分かりにくくすることができますとGAL4ドライバーラインは、関心のある特定の神経細胞での発現を駆動するのに利用可能でないかもしれません。 MARCM（REPを持つモザイク解析ressible細胞マーカー）法8は、個々 の細胞レベルで、本質的に任意のニューロンを標識しましたが、正常になぜならGAL80タンパク質の代謝回転の遅い胚と早期幼虫に使用することはできませんを提供することができます。
遺伝標識のこれらの制限を考えて、私たちは、 ショウジョウバエの胚において、単一ニューロンの色素注入は重要な手法のままで、広範なアプリケーションに値すると信じています。この目標を推進するために、我々はここで方法の詳細な説明を提供します。そのパワーのイラストが遅くショウジョウバエの胚14の腹部neuromeresにおける介在の完全なセットの形態の我々の最近のアカウントで提供されています。個々の神経細胞種の形態学的変動と胎児の中枢神経系における神経分節組織の原則の両方を明らかにしたこの研究では、現在使用可能な他の標識法では不可能だったでしょう。
Protocol
Representative Results
Discussion
モデル系としてショウジョウバエの一つの主要な利点は、単一細胞のレベルでの発達と機能の解析を可能にすることである。これは、細胞の種類の多様性は非常に高く、隣接する細胞の機能と形態が全く異なることがあります神経系に関しては特に便利です。
ここでお見せする方法は、永久染色剤や蛍光顕微鏡法による直接調べに変換することができる色素を持?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、DFGからGMTへの助成金によって支えられて
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DAB | Sigma-Aldrich | D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
| DiI | Invitrogen/Molecular Probes | D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
| Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
| Glycerol | Roth | 3783 | 70% in PBS |
| Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
| PBS | 1x | ||
| TRIS | Roth | 4855 | |
| Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
| DC – amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
| Coverslips | Menzel | BB018018A1 | 18 x 18 mm |
| Coverslips | Menzel | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
| Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
| Flat Capillaries | Hilgenberg | outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
| Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
| Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
| Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
| Object Slides | Marienfeld Superior | 1000000 | |
| Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
| Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
| Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1.
Riferimenti
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