El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

Se presenta una técnica para el etiquetado de las neuronas individuales en el sistema nervioso central (SNC) de<em> Drosophila</em> Embriones, lo que permite el análisis de la morfología neuronal ya sea por la luz transmitida o microscopía confocal.

Abstract

En este artículo se describe cómo etiquetar individualmente las neuronas en el sistema nervioso central embrionario de Drosophila melanogaster por inyección juxtacellular del lipofílico fluorescente Dil marcador de membrana. Este método permite la visualización de la morfología de las células neuronales en gran detalle. Es posible marcar cualquier célula en el SNC: cuerpos celulares de las neuronas diana son visualizadas bajo óptica DIC o por expresión de un marcador genético fluorescente tal como GFP. Después del marcaje, el Dil se puede transformar en una permanente mancha marrón por fotoconversión para permitir la visualización de la morfología celular con luz transmitida y la óptica DIC. Alternativamente, las células marcadas con Dil se puede observar directamente con la microscopía confocal, permite genéticamente introducidos proteínas indicadoras fluorescentes que se colocalizaban. La técnica se puede utilizar en cualquier animal, independientemente del genotipo, haciendo posible el análisis de fenotipos mutantes con una resolución de célula individual.

Introduction

El conocimiento de la morfología neuronal a nivel de células individuales es una condición previa esencial para la comprensión de la conectividad neuronal y la función del SNC. Así, desde los primeros días de la neurociencia, los investigadores han tratado de desarrollar técnicas de marcaje de células individuales (véase ⁷ para un tratamiento histórico de este número). Los métodos clásicos, tales como la tinción de Golgi proporcionar una excelente resolución de la morfología neuronal, pero no son adecuados si se busca una etiqueta en un tipo particular de neurona en forma dirigida, como la tinción se produce de una manera aleatoria. El desarrollo de métodos para la tinción de las células individuales por inyección intracelular o juxtacellular de colorantes de un microelectrodo se dirigió a la exigencia de un etiquetado específico.

La aplicación de una sola neurona de inyección de tinte para Drosophila presentó un desafío importante, debido al tamaño pequeño de tanto el organismo y sus neuronas. Sin embargo, la tinción única neurona de embriones de Drosophila </em> Neuronas se logró a mediados de la década de 1980 en el laboratorio de Corey Goodman ^15. Mientras que el método ha sido eminentemente útil y ha dado algunas ideas clave sobre los mecanismos para el desarrollo neuronal en Drosophila en los últimos 20-30 años (por ejemplo, ^{2, 10),} muchos trabajadores se han negado a ello, en gran parte debido a sus exigencias técnicas.

La disponibilidad en los años más recientes de técnicas genéticas para el etiquetado neuronal en Drosophila también ha contribuido a la impopularidad de la inyección de un solo tinte neurona. GAL4 expresión dirigida de los constructos de GFP específicos de membrana puede proporcionar una excelente resolución de la morfología neuronal ^{1, 20.} Sin embargo, este método tiene ciertas limitaciones: la expresión a menudo inevitable de GFP en las células múltiples puede oscurecer la estructura de las neuronas individuales, y una línea GAL4 conductor puede no estar disponible para conducir la expresión en una neurona particular de interés. El MARCM (Análisis Mosaico con un representantemarcador de células ressible) ⁸ método puede proporcionar un etiquetado de esencialmente cualquier neurona en el nivel de células individuales, pero no puede ser utilizado con éxito en el embrión y larva temprana debido a la lenta rotación de la proteína GAL80.

Dadas estas limitaciones de etiquetado genética, creemos que la inyección neurona solo tinte en el embrión de Drosophila sigue siendo una técnica valiosa y merece una aplicación más amplia. Para promover este objetivo, ofrecemos aquí una descripción detallada del método. Una ilustración de su potencia es proporcionada por nuestra cuenta reciente de la morfología de la serie completa de interneuronas en neuromeres abdominales de finales de los años ¹⁴ embrión de Drosophila. Este estudio, que reveló tanto la variabilidad morfológica de los distintos tipos de células neuronales y los principios de organización neuromere en el SNC del embrión, no habría sido posible con cualquier otro método de etiquetado disponibles en la actualidad.

Protocol

Hemos usado dos variantes ligeramente diferentes del método de etiquetado sola neurona en nuestros laboratorios. Las diferencias se refieren a la recogida de embriones, dechorionisation, devitellinisation y pasos de embrión de fileteado. Figura 1 ofrece una visión general de los pasos comunes y divergentes de las variantes. 1. Preparación de micro-agujas de disección de embriones y Micropipetas para Inyección Dye Agujas de vidrio para la disección de embrio…

Representative Results

La Figura 4 ilustra los resultados típicos de la técnica, como se describe aquí. Figura 4A muestra un ejemplo de un Dil llena interneuron único que se photoconverted limpiamente. Es muy bien demuestra la cantidad de detalle que ofrecen estas preparaciones. Cuando se observa bajo la óptica DIC el contexto espacial de la celda marcada dentro del tejido circundante no marcado se hace visible, por ejemplo, la posición del cuerpo de la celda dentro de la corteza y de la proyec…

Discussion

Una ventaja importante de Drosophila como sistema modelo es que permite el análisis del desarrollo y la función en el nivel de células individuales. Esto es especialmente útil en relación con el sistema nervioso, donde la diversidad de tipos de células es excepcionalmente alta y la función y la morfología de las células vecinas pueden ser totalmente diferentes.

El método que aquí presentamos permite el etiquetado de las neuronas individuales con un colorante que puede ser…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalogue Number	Comments
			REAGENTS
DAB	Sigma-Aldrich	D-5905	2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4
DiI	Invitrogen/Molecular Probes	D-282	1 mg/ml in ethanol
Formaldehyde	Merck Millipore		7,4 % in PBS
Glycerol	Roth	3783	70% in PBS
Heptane Glue	Beiersdorf AG	Cello 31-39-30 *	dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane
PBS			1x
TRIS	Roth	4855
Vectashield	Vector Laboratories	H1000
			EQUIPMENT
Confocal Microscope	Leica	TCS SP2	to view and document labelings in fluorescence
DC – amplifier	Dragan Corporation	Cornerstone ION-100	to perform the labelings
Coverslips	Menzel	BB018018A1	18 x 18 mm
Coverslips	Menzel	BB024060A1	24 x 60 mm
Dissecting Microscope	Leica	MZ8	to prepare and disect embryos
Flat Capillaries	Hilgenberg		outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm
Injection Capillaries	Science Products	GB 100 TF 8P
Micromanipulator R	Leica		to perform the labelings
Model P-97	Sutter Instruments		to pull capillaries
Object Slides	Marienfeld Superior	1000000
Scientific Microscope	Zeiss	Axioskop 2 mot	to view labelings after photoconversion
Scientific Microscope	Olympus	BX50	to perform the labelings
Sony MC3255 Video Camera	Sony/AVT Horn	Sony MC3255	to record labelings after photoconversion

Table 1.