Vi presenterar en teknik för märkning enstaka neuroner i det centrala nervsystemet (CNS) hos<em> Drosophila</em> Embryon, som tillåter analys av neuronal morfologi av antingen ljus eller konfokalmikroskopi.
I den här artikeln beskriver vi hur individuellt för att märka neuroner i embryonala CNS av Drosophila melanogaster genom juxtacellular injektion av lipofila fluorescerande membran markör Dil. Denna metod medger visualisering av neuronal cellmorfologi i detalj. Det är möjligt att märka någon cell i CNS: cellkroppar mål nervceller visualiseras i DIC optik eller genom uttryck av en fluorescerande genetisk markör som GFP. Efter märkning kan Dil omvandlas till en permanent brun fläck på photoconversion att tillåta visualisering av cellmorfologi med ljus och DIC optik. Alternativt, kan de Dil-märkta cellerna observeras direkt med konfokalmikroskopi, möjliggör genetiskt införts fluorescerande reporter proteiner som skall colocalised. Tekniken kan användas i alla djur, oavsett av genotyp, vilket gör det möjligt att analysera mutanta fenotyper vid enda cell upplösning.
Kunskap om neuronal morfologi vid enskilda celler är en viktig förutsättning för att förstå nervkopplingar och CNS-funktion. Således, från de tidigaste dagarna av neurovetenskap, har forskare försökt utveckla enskilda tekniker cell märkning (se 7 för en historisk behandling av denna fråga). Klassiska metoder såsom Golgi färgning ger utmärkt upplösning av neuronal morfologi men är inte lämpliga om man försöker märka en viss typ av neuron i ett riktat sätt, såsom färgning sker på ett slumpmässigt sätt. Utvecklingen av metoder för färgning enstaka celler genom intracellulära eller juxtacellular injektion av färgämnen från en mikroelektrod riktat kravet på särskild märkning.
Tillämpningen av enda neuron färgämne injektion till Drosophila en stor utmaning på grund av den lilla storleken på både organismen och dess nervceller. Trots enda neuron färgning av embryonala Drosophila </em> Neuroner uppnåddes i mitten av 1980-talet i laboratorium Corey Goodman 15. Medan metoden har i högsta grad användbar och har gett några viktiga insikter mekanismer för neuronal utveckling i Drosophila de senaste 20-30 åren (t.ex. 2, 10), har många arbetare skyggat från det, till stor del på grund av dess tekniska krav.
Tillgången på senare år av genetiska tekniker för neuronal märkning i Drosophila har också bidragit till impopularitet enda neuron färgämne injektion. GAL4-riktad uttryck av membran riktade GFP konstruktioner kan ge utmärkt upplösning av neurala morfologi 1, 20. Emellertid har denna metod vissa begränsningar: det ofta oundviklig uttryck av GFP i flera celler kan skymma struktur i enskilda neuroner och en GAL4 förare linje kanske inte är tillgängliga för att driva expression i en särskild neuron av intresse. Den marcm (Mosaik analys med ett repressible cellmarkör) metod 8 kan ge märkning av väsentligen varje neuron på individuell cellnivå, men kan inte med framgång användas i embryot och tidig larv grund av den långsamma omsättningen av GAL80-proteinet.
Med tanke på dessa begränsningar genetisk märkning, tror vi att enda neuron färgämne injektion i Drosophila embryot fortfarande en värdefull teknik och förtjänar bredare tillämpning. För att främja detta mål, tillhandahåller vi här en detaljerad beskrivning av metoden. En illustration av sin makt ges av vår senaste hänsyn till morfologi fullständig uppsättning interneuronen i buken neuromeres av den sena Drosophila embryot 14. Denna studie, som visade både den morfologiska variationen av individuella neuronala celltyper och principerna för neuromere organisation i CNS hos embryot, skulle inte ha varit möjligt med någon annan tillgänglig märkning metod.
En stor fördel med Drosophila som ett modell-system är att det tillåter analys av utveckling och funktion på nivån av enskilda celler. Detta är särskilt användbart när det gäller nervsystemet, där mångfalden av celltyper är exceptionellt hög och funktion och morfologi av angränsande celler kan vara helt annorlunda.
Den metod som vi presenterar här tillåter märkning av enskilda neuroner med ett färgämne som antingen kan omvandlas till en permanent fläck eller und…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett bidrag från DFG till GMT
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
REAGENTS | |||
DAB | Sigma-Aldrich | D-5905 | 2-3 mg/ml in 100 mM TRIS-Hcl, pH 7.4 |
DiI | Invitrogen/Molecular Probes | D-282 | 1 mg/ml in ethanol |
Formaldehyde | Merck Millipore | 7,4 % in PBS | |
Glycerol | Roth | 3783 | 70% in PBS |
Heptane Glue | Beiersdorf AG | Cello 31-39-30 * | dilute ca. 1 to 1 with n-Heptane |
PBS | 1x | ||
TRIS | Roth | 4855 | |
Vectashield | Vector Laboratories | H1000 | |
EQUIPMENT | |||
Confocal Microscope | Leica | TCS SP2 | to view and document labelings in fluorescence |
DC – amplifier | Dragan Corporation | Cornerstone ION-100 | to perform the labelings |
Coverslips | Menzel | BB018018A1 | 18 x 18 mm |
Coverslips | Menzel | BB024060A1 | 24 x 60 mm |
Dissecting Microscope | Leica | MZ8 | to prepare and disect embryos |
Flat Capillaries | Hilgenberg | outer diameter 1 mm; glas thickness 0.1 mm | |
Injection Capillaries | Science Products | GB 100 TF 8P | |
Micromanipulator R | Leica | to perform the labelings | |
Model P-97 | Sutter Instruments | to pull capillaries | |
Object Slides | Marienfeld Superior | 1000000 | |
Scientific Microscope | Zeiss | Axioskop 2 mot | to view labelings after photoconversion |
Scientific Microscope | Olympus | BX50 | to perform the labelings |
Sony MC3255 Video Camera | Sony/AVT Horn | Sony MC3255 | to record labelings after photoconversion |
Table 1.