Imagens ao vivo de Apuramento celular por apoptose durante<em> Drosophila</em> Embriogênese
Summary
Descrevemos aqui um método eficaz para o estudo da dinâmica de depuração de células apoptóticas<em> In vivo</em>. Este método emprega viver<em> Drosophila</em> Embriões como um poderoso modelo de monitorização da fagocitose de células apoptóticas através de marcação específica de células apoptóticas e fagócitos.
Abstract
A eliminação adequada de células indesejáveis ou aberrante através de apoptose e fagocitose subseqüente (clearance celular por apoptose) é crucial para o desenvolvimento normal em todos os organismos metazoários. Recarga celular por apoptose é um processo altamente dinâmico intimamente relacionado com a morte das células, as células apoptóticas unengulfed são mal vistas in vivo sob condições normais. A fim de compreender as diferentes etapas de depuração de células apoptóticas e comparar os fagócitos "profissionais" – macrófagos e células dendríticas em 'não profissional' – células vizinhas tecido residente, in vivo de imagens em directo do processo é extremamente valiosa. Aqui nós descrevemos um protocolo para estudar a liberação celular por apoptose em embriões de Drosophila ao vivo. Para acompanhar a dinâmica das diferentes etapas da fagocitose usamos marcadores específicos para células em apoptose e fagócitos. Além disso, podemos monitorar dois sistemas em paralelo fagócitos: macrófagos 'profissionais' e 'semi-profeglia ssional 'no sistema nervoso central em desenvolvimento (SNC). O método aqui descrito emprega o embrião de Drosophila como um modelo excelente para estudos de depuração de células apoptóticas em tempo real.
Introduction
A eliminação adequada de células indesejadas ou aberrante através de apoptose e fagocitose subsequente é crucial para o desenvolvimento embrionário, bem como para a homeostase dos tecidos no adulto. A fagocitose de células apoptóticas ou na depuração de células apoptóticas é um processo altamente dinâmico, que prossegue em quatro passos: (1) o recrutamento de fagócitos para a célula apoptótica ('encontrar-me'), (2) reconhecimento da célula como um alvo para a fagocitose ( 'comer-me') e (3) imersão, seguido de (4) e da maturação do fagossoma e degradação da partícula apoptótica 1-5. Existem dois tipos de fagócitos: macrófagos "profissionais" e as células dendríticas imaturas, e os "não-profissional" células vizinhas tecido residentes, que são cruciais para a liberação celular por apoptose durante metazoan desenvolvimento 6,7.
No desenvolvimento de Drosophila, a eliminação de células supérfluas por apoptose ocorre em três metrosfases Ain, pela primeira vez em meados da década de embrião e, em seguida, em meados pupa, e novamente na adulta. Durante a embriogênese partículas apoptóticos são removidos por fagócitos "profissionais", macrófagos e pelo "não-profissional" ectoderma e glia 8,9.
No nosso trabalho anterior, identificaram um receptor fagocitária, de seis mícrons, sob (SIMU), que é expresso exclusivamente em células fagocíticas durante a embriogénese. Usando o promotor simulação que gerou um marcador específico para as populações de células fagocíticas (simular cytGFP) que nos permite monitorar macrófagos, ectoderma e glia simultaneamente em um embrião em desenvolvimento ao vivo 8. Além disso, por utilização de marcadores específicos para células apoptóticas em diferentes fases da apoptose, que é capaz de seguir as dinâmicas de depuração de células apoptóticas in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Desembaraço celular por apoptose é um último estágio crítico de apoptose, que é altamente dinâmico. Portanto, estudos sobre o processo em tempo real são de extrema importância. Aqui nós descrevemos um protocolo que permite o monitoramento de folga celular por apoptose no desenvolvimento de embriões de Drosophila vivendo. Neste processo, duas populações de células deve ser marcado com marcadores específicos: células apoptóticas e fagócitos. O repórter simular cytGFP é adequado para m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma Marie Curie Reintegração Grant (IRG249084). Agradecemos a todos os membros do laboratório Kurant.
Materials
| Reagent | |||
| Annexin V | Molecular Probes | A35108 | |
| PhiPhiLux G2D2 | OncoImmunin | A304R2G-5 | |
| LysoTracker | Molecular Probes | L-7528 | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898 | |
| Material | |||
| Capillary tubing | FHC | 30-30-0 | |
| Cell Strainer | SPL | 93100 | |
| Paintbrush |
Riferimenti
- Kinchen, J. M. A model to die for: signaling to apoptotic cell removal in worm, fly and mouse. Apoptosis. 15, 998-1006 (2010).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagosome maturation: going through the acid test. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, 781-795 (2008).
- Kinchen, J. M., Ravichandran, K. S. Phagocytic signaling: you can touch, but you can’t eat. Curr. Biol. 18, 521-524 (2008).
- Stuart, L. M., Ezekowitz, R. A. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
- Lauber, K., Blumenthal, S. G., Waibel, M., Wesselborg, S. Clearance of apoptotic cells: getting rid of the corpses. Mol. Cell. 14, 277-287 (2004).
- Henson, P. M., Hume, D. A. Apoptotic cell removal in development and tissue homeostasis. Trends Immunol. 27, 244-250 (2006).
- Kurant, E. Keeping the CNS clear: glial phagocytic functions in Drosophila. Glia. 59, 1304-1311 (2011).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133, 498-509 (2008).
- Mergliano, J., Minden, J. S. Caspase-independent cell engulfment mirrors cell death pattern in Drosophila embryos. Development. 130, 5779-5789 (2003).
- van den Eijnde, S. M., et al. Cell surface exposure of phosphatidylserine during apoptosis is phylogenetically conserved. Apoptosis. 3, 9-16 (1998).
