Identificatie van<em> Sleeping Beauty</em> Transposon inserties in vaste tumoren met Linker-gemedieerde PCR
Summary
Werkwijze voor het identificeren van onbekende oorzaken van kanker met een objectieve benadering beschreven. De methode maakt gebruik van de<em> Sleeping Beauty</em> Transposon een willekeurige mutageen gericht op specifieke weefsels. Genomic in kaart brengen van transposon inserties die tumorvorming rijden identificeert nieuwe oncogenen en tumor suppressor genen
Abstract
Genomic, proteomics, transcriptoom, en epigenomisch analyses van menselijke tumoren aan te geven dat er duizenden van afwijkingen binnen elke kanker genoom in vergelijking met geëvenaard normaal weefsel. Op basis van deze analyses is het duidelijk dat er vele onbekende genetische oorzaken van kanker 1. Helaas zijn deze drivers zijn verborgen in een veel groter aantal passagiers afwijkingen in het genoom die niet direct bijdragen aan de vorming van tumoren. Een ander aspect van de kanker genoom dat er een aanzienlijke genetische heterogeniteit binnen soortgelijke tumortypen. Elke tumor kan haven verschillende mutaties die een selectief voordeel voor tumorvorming 2 verzoekt. Het uitvoeren van een onpartijdige vooruit genetische screen in muizen biedt de tools om tumoren te genereren en analyseren van hun genetische samenstelling, terwijl het verminderen van de achtergrond van de passagier mutaties. The Sleeping Beauty (SB) transposon systeem is een dergelijke methode 3. Het SB systeem maakt gebruik van mobiele vEctors (transposons) die het gehele genoom worden ingebracht door de transposase enzym. Mutaties zijn beperkt tot een specifiek celtype door het gebruik van een voorwaardelijke transposase allel dat wordt geactiveerd door Cre recombinase. Veel muis lijnen bestaan die uitdrukkelijke Cre-recombinase in specifieke weefsels. Door kruising van een van deze lijnen de voorwaardelijke transposase allel (bijvoorbeeld Lox-stop-Lox-SB11) wordt de SB systeem alleen geactiveerd in cellen die Cre recombinase. Het Cre-recombinase zal accijnzen een stop cassette dat blokkeert de expressie van het transposase allel, waardoor het activeren van transposon mutagenese binnen het aangewezen celtype. Een SB scherm wordt geïnitieerd door drie stammen fokken van transgene muizen, zodat de experimentele muizen dragen een voorwaardelijke transposase allel een concatamer van transposons en een weefsel-specifieke Cre recombinase allel. Deze muizen mogen leeftijd tot tumoren vorm en ze worden ten dode opgeschreven. De muizen worden vervolgenssterven en genomisch DNA wordt geïsoleerd uit de tumoren. Vervolgens wordt het genomische DNA onderworpen aan linker-gemedieerde PCR (LM-PCR) die resulteert in amplificatie van genomische loci die een transposon SB. LM-PCR uitgevoerd op een tumor zal resulteren in honderden verschillende amplicons die de honderden genomische loci die transposon inserties in een tumor 4. Het transposon inserties in alle tumoren worden geanalyseerd en gemeenschappelijke insteekopeningen (CISS) geïdentificeerd met behulp van een geschikte statistische methode 5. Genen binnen de CIS zeer waarschijnlijk oncogenen of tumor suppressor genen, en worden beschouwd als kandidaat kankergenen. De voordelen van het systeem SB kandidaat kanker genen te identificeren zijn: 1) het transposon gemakkelijk kan worden gelokaliseerd in het genoom omdat de sequentie bekend is, 2) de omzetting kan worden gericht op bijna elk celtype en 3) het transposon kan introductie van zowel de winst-en verlies-van-functie mutaties 6. De following protocol wordt beschreven hoe u bedenken en uitvoeren van een voorwaartse genetische screen gebruik van de SB transposon systeem voor kandidaat-kanker genen (Figuur 1) te identificeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een voorwaartse genetische scherm met behulp van de Sleeping Beauty transposon systeem biedt een methode voor het identificeren van mutaties die kanker veroorzaken. Door de juiste promotor Cre recombinase controle naast eventuele predisponerende mutaties zal de SB scherm identificeren bekende en nieuwe kandidaat kankergenen.
Het succes van een SB scherm is grotendeels afhankelijk van de geselecteerde muizen voor het maken van het scherm. Voor het transposon, raden wij u aan…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Branden Moriarity, David Largaespada, en Vincent Keng dank aan de Universiteit van Minnesota, en Adam Dupuy aan de Universiteit van Iowa voor hun hulp bij de ontwikkeling van het hierboven beschreven protocol.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Sure-Seal Induction Chamber | Brain Tree Scientific | EZ-177 | |
| Cryovial | Bioexpress | C-3355-2 | |
| 10% Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Protein Precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| Cell lysis buffer | Qiagen | 158906 | |
| Proteinase K | Qiagen | 158920 | |
| RNase A | Qiagen | 158924 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| BfaI | New England Biolabs | R0568S | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | |
| MinElute 96 well plates | Qiagen | 28051 | |
| QIAvac 96 Vacuum manifold | Qiagen | 19504 | |
| Multi-MicroPlate Genie, 120V | Scientific Industries, Inc. | SI-4000 | |
| T4 DNA ligase with 5x ligation Buffer | Invitrogen | 15224-041 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| 25mM dNTPs | Bioexpress | C-5014-200 | |
| Platinum Taq | Invitrogen | 10966-034 | |
| FastStart Taq DNA Polymerase | Roche | 12032929001 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| TAE Buffer | Promega | V4271 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| Ethidium bromide | Promega | H5041 |
Riferimenti
- Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61, 759-767 (1990).
- Wood, L. D., et al. The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
- Starr, T. K., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon. Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).
- Mueller, P. R., Wold, B. In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Bergemann, T. L., et al. New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens. Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Harnessing transposons for cancer gene discovery. Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).
- Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse. Nature. 436, 272-276 (2005).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323, 1747-1750 (2009).
- Keng, V. W., et al. A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma. Nature. 27, 264-274 (2009).
- Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system. Nature. 436, 221-226 (2005).
