Identificação de<em> A Bela Adormecida</em> Inserções de transposões em tumores sólidos utilizando Linker mediada por PCR
Summary
Um método de identificação de condutores desconhecidos da carcinogénese, utilizando uma abordagem imparcial é descrito. O método utiliza o<em> A Bela Adormecida</em> Transposon como um mutagéneo aleatória dirigida a tecidos específicos. Mapeamento genómico de inserções de transposões que conduzem a formação de tumores identifica novos oncogenes e genes supressores tumorais
Abstract
Genômica, proteômica análises, transcriptomic, e epigenômico de tumores humanos indicam que existem milhares de anomalias dentro de cada genoma do câncer em comparação com o tecido normal combinado. Com base nessas análises, é evidente que há muitos condutores não descobertas genéticas do câncer 1. Infelizmente esses drivers estão escondidos dentro de um número muito maior de anomalias de passageiros no genoma que não contribuem diretamente para a formação de tumor. Outro aspecto do genoma do cancro é que existe uma grande heterogeneidade genética considerável dentro semelhantes tipos de tumores. Cada tumor pode abrigar mutações diferentes que proporcionam uma vantagem seletiva para a formação do tumor 2. Realizando uma tela para a frente imparcial genética em ratos fornece as ferramentas para gerar tumores e analisar sua composição genética, além de reduzir o fundo de mutações de passageiros. The Sleeping Beauty (SB) sistema transposon é um tal método 3. O sistema utiliza o SB móvel vectors (transposons) que pode ser inserido por todo o genoma da enzima transposase. As mutações são limitados a um tipo de célula específico através da utilização de um alelo de transposase condicional que é activado pela recombinase Cre. Existem muitas linhas de ratinhos que expressa recombinase Cre em tecidos específicos. Ao cruzar uma dessas linhas para o alelo transposase condicional (por exemplo, pára–Lox Lox-SB11), o sistema de SB é activado apenas nas células que expressam Cre recombinase. A recombinase Cre vontade extirpar uma cassete de batente, que bloqueia a expressão do alelo de transposase, activando assim a mutagénese transposon dentro do tipo de célula designada. Uma tela de SB é iniciada por meio de cruzamento três estirpes de ratinhos transgénicos de modo a que os ratinhos experimentais portadores de um alelo transposase condicional, um concatamer de transposões, e um tecido específico de alelo recombinase Cre. Estes ratos são autorizados a idade até se formarem tumores e tornam-se moribundos. Os ratos são entãoDNA genómico necropsiados e é isolado a partir de tumores. Em seguida, o ADN genómico é submetido a linker mediada-PCR (LM-PCR), que resulta em amplificação de loci genómicos contendo um transposon SB. LM-PCR realizada sobre um único tumor vai resultar em centenas de amplicons distintas, representando as centenas de loci genómicos contendo inserções de transposões em um único tumor 4. As inserções de transposões, em todos os tumores são analisados e locais de inserção comuns (CIS) são identificadas usando um método estatístico adequado 5. Genes dentro da CEI são altamente susceptíveis de ser oncogenes ou genes supressores de tumores, e são considerados genes de cancro candidatas. As vantagens de utilizar o sistema de SB para identificar genes candidatos cancerosas são: 1) o transposão pode ser facilmente localizado no genoma, porque a sua sequência é conhecida, 2) a transposição pode ser dirigido para quase qualquer tipo de célula e 3) o transposon seja capaz de introdução simultânea de ganho e perda de função-mutações 6. O following protocolo descreve a forma de conceber e realizar uma tela para a frente utilizando a genética SB sistema transposon para identificar genes candidatos cancro (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Uma tela para a frente genética utilizando o sistema Sleeping Beauty transposon fornece um método para identificar mutações que causam câncer. Ao seleccionar o promotor adequado para controlar a recombinase Cre para além de quaisquer mutações de predisposição, a tela SB identificará conhecidos e novos genes de cancro candidatas.
O sucesso de uma tela de SB é largamente dependente dos ratos seleccionados para criar a tela. Para o transposon, recomendamos o uso de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer Branden Moriarity, David Largaespada, e Vincent Keng da Universidade de Minnesota, e Adam Dupuy da Universidade de Iowa para a sua assistência no desenvolvimento do protocolo descrito acima.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Sure-Seal Induction Chamber | Brain Tree Scientific | EZ-177 | |
| Cryovial | Bioexpress | C-3355-2 | |
| 10% Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Protein Precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| Cell lysis buffer | Qiagen | 158906 | |
| Proteinase K | Qiagen | 158920 | |
| RNase A | Qiagen | 158924 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| BfaI | New England Biolabs | R0568S | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | |
| MinElute 96 well plates | Qiagen | 28051 | |
| QIAvac 96 Vacuum manifold | Qiagen | 19504 | |
| Multi-MicroPlate Genie, 120V | Scientific Industries, Inc. | SI-4000 | |
| T4 DNA ligase with 5x ligation Buffer | Invitrogen | 15224-041 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| 25mM dNTPs | Bioexpress | C-5014-200 | |
| Platinum Taq | Invitrogen | 10966-034 | |
| FastStart Taq DNA Polymerase | Roche | 12032929001 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| TAE Buffer | Promega | V4271 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| Ethidium bromide | Promega | H5041 |
Riferimenti
- Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61, 759-767 (1990).
- Wood, L. D., et al. The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
- Starr, T. K., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon. Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).
- Mueller, P. R., Wold, B. In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Bergemann, T. L., et al. New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens. Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Harnessing transposons for cancer gene discovery. Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).
- Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse. Nature. 436, 272-276 (2005).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323, 1747-1750 (2009).
- Keng, V. W., et al. A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma. Nature. 27, 264-274 (2009).
- Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system. Nature. 436, 221-226 (2005).
