Tanımlanması<em> Sleeping Beauty</emLinker-aracılı PCR kullanarak Solid Tümörlerde> Transposon Eklemeler
Summary
Tarafsız bir yaklaşım kullanarak karsinogenez bilinmeyen sürücüsü tespit için bir yöntem tarif edilmektedir. Yöntem kullanır<em> Sleeping Beauty</emBelirli dokulara yönelik rastgele bir mutajen olarak> transpozon. Tümör oluşumunu tahrik transpozon insersiyon Genomik haritalama roman onkogenler ve tümör baskılayıcı genler belirler
Abstract
Insan tümörlerinin genomik, proteomik Transkriptomik ve epigenomic analizler eşleştirilmiş normal dokuya göre her kanser genom içerisindeki anomalilerin binlerce olduğunu göstermektedir. Bu analizlere dayanarak kansere 1 keşfedilmeyen birçok genetik sürücü olmadığını açıktır. Ne yazık ki bu sürücüler doğrudan tümör oluşumuna katkıda bulunmayan genomundaki yolcu anomalilerin çok daha fazla sayıda içinde gizlidir. Kanser genomun bir başka yönü de benzer tümör tipleri içinde hatırı sayılır genetik heterojenlik olmasıdır. Her tümör tümör oluşumu 2 bir selektif avantaj sağlayan farklı mutasyon barındırabilir. Yolcu mutasyonlar arka azaltırken farelerde tarafsız bir ileri genetik ekran Sahne, tümörler oluşturmak ve kendi genetik kompozisyon analiz etmek için araçlar sağlar. Sleeping Beauty (SB) transpozon sistemi böyle bir yöntem 3'tür. SB sistemi mobil v kullanırtransposase enzim tarafından genomu boyunca yerleştirilebilir ectors (transpozonlar). Mutasyonlar, Cre rekombinaz tarafından aktive olan bir koşullu transposase alelinin kullanımı ile belirli bir hücre tipi ile sınırlıdır. Birçok fare hatları belli dokularda bulunduğunu ifade Cre Rekombinaz var. Koşullu transposase alleli (örn. Lox-stop-Lox-SB11) şu satırları birini geçerek, SB sistem sadece ifade Cre Rekombinaz hücreleri aktive edilir. Cre Rekombinaz ÖTV durak kaset olacak ki böylece belirlenmiş hücre tipi olan transpozon mutajenez aktive transposase allel blok ifadesi. Deneysel fareler bir şartlı transposase alel, transpozonlar bir concatamer, ve bir doku-spesifik Cre rekombinaz alleli böylece bir SB ekran transgenik farelerde üç cins üreme ile başlatılır. Bu fareler tümörler şeklinde yaşına kadar izin ve can çekişen hale gelir. Daha sonra fareler bulunmaktadırnekropsi ve genomik DNA tümör izole edilmiştir. Daha sonra, genomik DNA bağlayıcı aracılı-PCR ile yapılmıştır (LM-PCR) bir SB transpozon içeren genomik bir lokus amplifikasyon olarak sonuçlanır. LM-PCR, tek bir tümör 4 transpozon eklemeler içeren genomik lokus yüzlerce temsil farklı amplikonlarının yüzlerce neden olacaktır tek bir tümör üzerinde gerçekleştirildi. Tüm tümörlerde transpozon eklemeleri analiz edilir ve ortak ekleme siteleri (CISs) uygun istatistiksel metodun 5 kullanılarak tanımlanır. BDT içindeki genler onkogenler ve tümör baskılayıcı genler olması kuvvetle muhtemeldir, ve aday kanser genleri kabul edilir. Kanser aday genlerin tanımlanması için SB sistemini kullanmanın avantajları şunlardır: kendi dizisi, 2 bilindiğinden, 1) transpozon kolaylıkla aktarılması hemen hemen herhangi bir hücre tipi yönlendirilir ve 3) transpozon yeteneğine sahip olabilir) genomuna yerleştirilebilir tanıtan hem kazanç ve kayıp fonksiyon-mutasyonlar 6. Following protokolü aday kanser genleri (Şekil 1) tanımlamak için SB transpozon sistemini kullanan bir ileri genetik ekran hazırlamak ve yürütmek açıklamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Uyuyan güzel transpozon sistemi kullanan bir ileri genetik ekran neden olan kanser mutasyonları tanımlamak için bir yöntem sağlar. Herhangi hazırlayıcı mutasyon ek olarak Cre rekombinaz kontrol etmek için uygun bir promotörün seçerek, SB ekran bilinen belirlemek ve yeni aday genleri kanser olacaktır.
Bir SB ekranının başarısı ekranı yaratmak için seçilen fareler üzerinde büyük ölçüde bağlıdır. Transpozon için, farklı kromozomlar 7…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar protokolü yukarıda açıklanan geliştirme konusundaki yardım için Iowa Üniversitesi Minnesota Üniversitesi'nde Branden Moriarty, David Largaespada ve Vincent Keng teşekkür, ve Adam Dupuy olurdu.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Sure-Seal Induction Chamber | Brain Tree Scientific | EZ-177 | |
| Cryovial | Bioexpress | C-3355-2 | |
| 10% Buffered Formalin | Sigma Aldrich | HT501128-4L | |
| Protein Precipitation solution | Qiagen | 158910 | |
| Cell lysis buffer | Qiagen | 158906 | |
| Proteinase K | Qiagen | 158920 | |
| RNase A | Qiagen | 158924 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| BfaI | New England Biolabs | R0568S | |
| NlaIII | New England Biolabs | R0125S | |
| MinElute 96 well plates | Qiagen | 28051 | |
| QIAvac 96 Vacuum manifold | Qiagen | 19504 | |
| Multi-MicroPlate Genie, 120V | Scientific Industries, Inc. | SI-4000 | |
| T4 DNA ligase with 5x ligation Buffer | Invitrogen | 15224-041 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| 25mM dNTPs | Bioexpress | C-5014-200 | |
| Platinum Taq | Invitrogen | 10966-034 | |
| FastStart Taq DNA Polymerase | Roche | 12032929001 | |
| Agarose | Promega | V3121 | |
| TAE Buffer | Promega | V4271 | |
| TE Buffer | Promega | V6232 | |
| Ethidium bromide | Promega | H5041 |
Riferimenti
- Fearon, E. R., Vogelstein, B., et al. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 61, 759-767 (1990).
- Wood, L. D., et al. The Genomic Landscapes of Human Breast and Colorectal Cancers. Science. 318, 1108-1113 (2007).
- Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvák, Z. Molecular Reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like Transposon from Fish, and Its Transposition in Human Cells. Cell. 91, 501-510 (1997).
- Starr, T. K., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery using the Sleeping Beauty transposon. Cell Cycle. 4, 1744-1748 (2005).
- Mueller, P. R., Wold, B. In Vivo Footprinting of a Muscle Specific Enhancer by Ligation Mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
- Bergemann, T. L., et al. New methods for finding common insertion sites and co-occurring common insertion sites in transposon- and virus-based genetic screens. Nucleic acids research. 40, 3822-3833 (2012).
- Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Harnessing transposons for cancer gene discovery. Nature Reviews Cancer. 10, 696-706 (2010).
- Collier, L. S., Carlson, C. M., Ravimohan, S., Dupuy, A. J., Largaespada, D. A. Cancer gene discovery in solid tumours using transposon-based somatic mutagenesis in the mouse. Nature. 436, 272-276 (2005).
- Starr, T. K., et al. A transposon-based genetic screen in mice identifies genes altered in colorectal cancer. Science. 323, 1747-1750 (2009).
- Keng, V. W., et al. A conditional transposon-based insertional mutagenesis screen for genes associated with mouse hepatocellular carcinoma. Nature. 27, 264-274 (2009).
- Dupuy, A. J., Akagi, K., Largaespada, D. A., Copeland, N. G., Jenkins, N. A. Mammalian mutagenesis using a highly mobile somatic Sleeping Beauty transposon system. Nature. 436, 221-226 (2005).
