Stereotactische injectie van MicroRNA expressie Lentivirussen om de muis Hippocampus CA1 regio en Evaluatie van de Behavioral Outcome
Summary
MicroRNA een belangrijke rol spelen in hersenstructuur en functie. Hier beschrijven we een methode om hippocampus miRNA dwingen over-expressie met behulp van stereotactische injectie van een aangelegde miRNA-expressie lentivirus. Deze benadering kan dienen als een relatief snelle manier om te beoordelen<em> In vivo</em> Effecten van over-expressie miRNA's in specifieke hersengebieden.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) zijn kleine reglementaire enkelstrengs RNA-moleculen ongeveer 22 nucleotiden lang, dat kan elke doelgroep talrijke mRNA-transcripten en dim een hele genexpressie traject door het induceren van vernietiging en / of het remmen van vertaling van deze doelstellingen. Verschillende miRNAs een belangrijke rol spelen bij het handhaven van neuronale structuur en functie en in hogere hersenfuncties, en methoden worden gezocht voor het manipuleren van hun niveaus voor het verkennen van deze functies. Hier presenteren we een directe in-vivo methode voor de behandeling van de cognitieve gevolgen van gedwongen miRNAs overtollige bij muizen door stereotactische injectie van miRNA-codering virusdeeltjes. In het bijzonder, het huidige protocol omvat injectie in de hippocampus CA1 regio, wat bijdraagt aan zoogdieren geheugen consolidatie, leren, en stressrespons, en biedt een handige injectieplaats. De coördinaten worden gemeten volgens de muis bregma en virus perfusie digitaal gestuurd en zeer traag gehouden.Na injectie, wordt de operatie wond verzegeld en de dieren herstellen. Lentiviruses coderen geluiddempers van de overeenkomstige mRNA doelen dienen om de specifieke miRNA / target interactie verantwoordelijk zijn voor het waargenomen effect impliceren, met naïeve muizen, muizen geïnjecteerd met een zoutoplossing en muizen geïnjecteerd met "lege" lentivirus vectoren als controles. Een maand na de injectie worden de dieren onderzocht in het Morris Water Maze (MWM) voor het beoordelen van hun navigatie leren en geheugen capaciteiten. De MWM is een ronde tank gevuld met gekleurd water met een klein platform ondergedompeld 1 cm onder het wateroppervlak. Gestage visuele aanwijzingen rond de tank zorgen voor ruimtelijke navigatie (geluid en magnetische veld van de aarde kan ook de dieren te helpen navigeren). Videocamera controle maakt het meten van de route van zwemmen en de tijd te vinden en bedraagt het platform. De muis wordt eerst geleerd dat het monteren van de verborgen platform biedt een ontsnapping aan de gedwongen zwemmen, het wordt dan getest voor het gebruik van deze ontsnapping en fenslotte, wordt het platform verwijderd en probetesten onderzoeken of de muis onthoudt de vorige locatie. Herhaalde tests een aantal dagen achtereen markeren verbeterde prestaties van de geteste muizen op kortere wachttijden te vinden en monteren van het platform, en als meer directe routes naar het platform of de locatie te bereiken. Bij no-show dergelijke verbetering vertegenwoordigt slechtzienden leren en geheugen en / of angst, die dan specifiek kan worden getest (bv. in de verhoogde plus maze). Deze aanpak maakt validatie van specifieke miRNAs en target transcripten in de bestudeerde cognitieve en / of stress-gerelateerde processen.
Introduction
De rol van bepaalde miRNA's in het zenuwstelsel functioneren is onlangs uitgedaagd door lentivirale injectie in verschillende studies. MiRNAs zijn gevonden van cruciaal belang voor het behoud en het opnieuw vormgeven synaps structuur 1, synaptogenese 2 en synaps verbouwing en onderhoud 3 te zijn. Deze studies suggereren sterk dat miRNAs betrokken zijn, via multileveled regulerende effecten in zowel de vormgeving en het behoud van de hoofduitgang van het zenuwstelsel, cognitieve functie. Stereotactische injectie van lentivirus deeltjes in specifieke regio's in de knaagdieren hersenen in staat stelt te zoeken naar veranderingen in de synaps morfologie en neuronale activiteit, en werd gebruikt voor het vaststellen van de functionele betekenis van overexpressie gebrachte transcripten 4,5. Directe infectie van neuronen bij welbepaalde hersengebieden met miRNA-expressie lentiviruses kunnen worden betrokken bij studies van veroudering, hersenaandoeningen en neurodegeneratie; Studies van miRNAs in het gebied van 6-8 gedragregulatie zijn dan veel minder gevorderd stadium en stereotactische injectie van miRNA-expressie lentivirus deeltjes gevolgd door gedragstesten kunnen nuttig zijn voor deze doeleinden. Een aanzienlijk meer bewerkelijke methode voor het induceren van over-of onder-expressie impliceert genetisch gemanipuleerde knock-in of knock-out muizen. Genetische systemen kan verder zorgen voor voorwaardelijke en temporele controle van expressie (bijv. Cre-Lox, Tet systemen), maar deze hebben nauwelijks ruimtelijke specificiteit van de injectieprocedure en er is bijna altijd een zekere mate van lekkage. Ook moet je de technische procedures niet operatie nodig en kan over laboratoria met een relatief goede reproduceerbaarheid worden gebruikt, maar ze zijn langzamer en vereisen veel meer mankracht en financiële middelen. Bovendien, de temporele controle van de over-of onder-expressie in muizen geïnjecteerd veel nauwkeuriger vergelijking met genetisch gemanipuleerde muizen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereotactische injectie van een lentivirus is een relatief snelle methode voor in vivo evaluatie voor zowel up-of down-regulatie van verschillende genen en miRNAs. Het belangrijkste alternatief is een genetisch gemanipuleerde muis wat een veel meer arbeidsintensief en tijdrovend techniek dan direct lentivirus injectie. Bovendien, de omhoog regulering, in lentivirus injectie plaats op een bepaald tijdstip in de volwassen muis en de mogelijkheid van lekkage omvat niet tijdens de ontwikkeling, zoals meestal het g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de Edmond en Lily Safra Center for Brain Sciences (SB fellowship), The Legacy Heritage Biomedical Science Partnership Program van de Israel Science Foundation (Grant No 378/11, naar HS) en de Duitse Israëlische Stichting Wetenschappelijk Onderzoek en ontwikkeling (GIF) (Grant No 1093-32.2/2010, naar HS).
Materials
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment – Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 |
References
- Siegel, G., et al. A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis. Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).
- Jin, P., et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway. Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).
- Simon, D. J. The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions. Cell. 133, 903-915 (2008).
- Consiglio, A. In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice. Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).
- Jakobsson, J., Lundberg, C. Lentiviral vectors for use in the central nervous system. Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).
- Berson, A. Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer’s disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice. EMBO Molecular Medicine. , (2012).
- Haramati, S. MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).
- Shaltiel, G., et al. Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target. Brain Structure & Function. , 10-1007 (2012).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs & transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).
- Nunez, J. Morris Water Maze Experiment. J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).
- Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer’s disease model mice. J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).
- Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. Genetic approach for intracerebroventricular delivery. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).
