Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome
Summary
MicroRNAs haben eine bedeutende Rolle in der Struktur des Gehirns und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um durchzusetzen Hippocampus miRNA-Überexpression mit stereotaktische Injektion eines gentechnisch miRNA-Expression lentivirus. Dieser Ansatz kann als eine relativ schnelle Weg zu der Beurteilung dienen<em> In vivo</em> Auswirkungen der überexprimierten miRNAs in spezifischen Hirnregionen.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind kleine regulatorische einzigen RNA-Moleküle etwa 22 Nukleotide lange, die kann jeder Ziel-mRNA-Transkripte und zahlreiche dim eine ganze Genexpression Weg durch Induktion Zerstörung und / oder Hemmung der Translation dieser Ziele. Mehrere miRNAs eine wichtige Rolle spielen bei der Aufrechterhaltung neuronaler Struktur und Funktion und in höheren Funktionen des Gehirns, und Methoden zur Manipulation ihrer Ebenen für die Erkundung dieser Funktionen gesucht. Hier präsentieren wir einen direkten in vivo-Verfahren zur Untersuchung der kognitiven Folgen der erzwungenen miRNAs Überschuss in Mäusen durch stereotaktische Injektion von miRNA-encoding Viruspartikel. Konkret beinhaltet das aktuelle Protokoll Injektion in den Hippocampus CA1-Region, die Säugetier-Speicher-Konsolidierung, Lernen und Stress-Reaktionen beiträgt und bietet eine bequeme Injektionsstelle. Die Koordinaten werden gemäß der Maus bregma und Viren Perfusion digital gesteuert und gehalten sehr langsam gemessen.Nach der Injektion wird die Operation Wunde verschlossen und die Tiere erholen. Lentiviren kodiert Schalldämpfer der entsprechenden mRNA Ziele dienen, um die spezifische miRNA / Target-Wechselwirkung verantwortlich für den beobachteten Effekt implizieren, mit naiven Mäuse, Mäuse mit Kochsalzlösung und Mäuse mit "leeren" Lentivirusvektoren als Kontrollen injiziert. Einen Monat nach der Injektion werden die Tiere in der Morris Water Maze (MWM) zur Beurteilung ihrer Navigation Lernen und Gedächtnis Fähigkeiten untersucht. Die MWM ist ein runder Behälter mit gefärbtem Wasser mit einer kleinen Plattform 1 cm unter der Wasseroberfläche untergetaucht gefüllt. Stetige visuelle Hinweise um den Tank für die räumliche Navigation (Ton und der Erde das Magnetfeld kann auch helfen, die Tiere in der Navigation) erlauben. Videokamera-Überwachung ermöglicht die Messung der Strecke von Bad und die Zeit zu finden und betragen die Plattform. Die Maus wird zuerst gelehrt, dass die versteckte Montage-Plattform bietet einen Ausweg aus der erzwungenen Schwimmen, es wird dann für die Verwendung dieser Flucht-und f getestetndlich ist die Plattform entfernt und Sonde Tests prüfen, ob die Maus erinnert sich an seine früheren Standort. Wiederholte Tests über mehrere Tage hintereinander markieren verbesserte Leistung der getesteten Mäuse in kürzeren Latenzzeiten zu finden und montieren Sie die Plattform, und da immer mehr direkte Wege, um die Plattform oder seine Position zu erreichen. Bei Nichterscheinen solche Verbesserung stellt beeinträchtigt Lernen und Gedächtnis und / oder Angst, die dann geprüft werden kann speziell (zB im erhöhten Plus-Labyrinth). Dieser Ansatz ermöglicht die Validierung von spezifischen miRNAs und Ziel-Transkripte in der untersuchten kognitiven und / oder Stress-Prozesse.
Introduction
Die Rolle von miRNAs in bestimmten Funktion des Nervensystems wurde kürzlich von lentiviralen Injektion in mehreren Studien in Frage gestellt worden. MiRNAs gefunden werden entscheidend für die Aufrechterhaltung und Umformen Synapse Struktur 1, 2 und Synaptogenese Synapse Umbau und Wartung 3. Diese Studien deuten stark darauf hin, dass miRNAs tätig sind, über vielschichtigen regulatorische Effekte sowohl in der Gestaltung und bei der Aufrechterhaltung der Hauptausgang des Nervensystems, die kognitive Funktion. Stereotaktische Injektion von Lentivirus Teilchen in bestimmten Regionen im Gehirn von Nagetieren ermöglicht die Suche nach Änderungen in Synapse Morphologie und neuronaler Aktivität und wurde für die Herstellung der funktionelle Bedeutung überexprimierten Transkripte 4,5 verwendet. Direkte Infektion von Neuronen an wohldefinierten Hirnareale mit miRNA-exprimierenden Lentiviren kann in Studien des Alterns, Gehirn-Erkrankungen und Neurodegeneration beteiligt sein; Studium der miRNAs im Bereich der Verhaltens-Regulierung 6-8 sind in einer weit weniger fortgeschrittenen Stadium, und stereotaktische Injektion von miRNA-Expression lentivirus Teilchen durch Verhaltenstests gefolgt kann nützlich sein, für solche Zwecke. Eine wesentlich aufwendigere Verfahren zur Induktion über-oder unter-Ausdruck beinhaltet gentechnisch Knock-in-oder Knockout-Mäusen. Genetische Systeme können weiter für die bedingte und zeitliche Steuerung der Expression (zB Cre-Lox, Tet-Systeme) ermöglichen, aber diese bieten kaum die räumliche Spezifität der Injektion und es gibt fast immer eine gewisse Undichtigkeit. Auch müssen die technischen Verfahren nicht operiert und kann über Labors mit relativ guter Reproduzierbarkeit verwendet werden, jedoch sind sie langsamer und benötigen viel mehr personelle und finanzielle Ressourcen. Darüber hinaus ist die zeitliche Steuerung der Über-oder Unter-Expression in injizierten Mäusen ist weitaus genauer verglichen mit gentechnisch veränderten Mäusen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Stereotaktische Injektion eines Lentivirus ist ein relativ schnelles Verfahren zur in vivo Beurteilung sowohl Vorwärts-oder Rückwärts-Regulation verschiedener Gene und miRNA. Die wichtigste Alternative ist eine gentechnisch veränderte Maus, die ein viel mühsame und zeitaufwendige Technik dann direkt lentivirus Injektion ist. Darüber hinaus ist die Regelung bis in lentivirus Injektion, tritt zu einem bestimmten Zeitpunkt in der erwachsenen Maus und beinhaltet keine Möglichkeit Undichtigkeit während der E…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der Edmond und Lily Safra Center for Neurowissenschaften (SB Gemeinschaft), The Legacy Heritage Biomedical Science Partnership Programm der Israel Science Foundation (Grant No 378/11, zu HS) und der Deutsch-Israelischen Stiftung für wissenschaftliche unterstützt Forschung und Entwicklung (GIF) (Grant No 1093-32.2/2010 zu HS).
Materials
| Equipment | |||
| Rodent weigh scale | Burtons (UK) | 115-455 | |
| heating pad | FIRstTechnology | DCT-25 | |
| trimming machine | Stoelting | 51465 | |
| stereotact | Stoelting | 51730 | |
| Scalpel and blades | Kent scientific | INS500348 | |
| Harland syringe | Hamilton | 7632-01 | |
| driller | Stoelting | 51449 | |
| digital pump | Harvard apparatus | 704507 | |
| Water tank and platform | Stoelting | 60135 |
| Reagents | |||
| ketamine | Vetoquinol(Lure France) | 3055503 | |
| domitor | Orion pharma | 107140-10 | |
| Rimadyl | Pfizer animal health | 24751 | |
| moisture ointment – Synthomycine 5% | Rekah Pharmaceutical | 195 | |
| histoacryl | Braun | 112101 | |
| saline | Sigma Aldrich | D8662 |
Riferimenti
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