Een protocol voor de nanodeeltjes tracking analyse (NTA) en high-throughput flowcytometrie om polymere genafgifte nanodeeltjes evalueren beschreven. NTA wordt gebruikt om de nanodeeltjes deeltjesgrootteverdeling en het plasmide per deeltjesverdeling karakteriseren. High-throughput flowcytometrie in staat stelt kwantitatieve transfectie efficiëntie evaluatie voor een bibliotheek van gen delivery biomaterialen.
Niet-virale gen-levering met gebruik van polymere nanodeeltjes heeft zich ontpopt als een aantrekkelijke aanpak voor gentherapie voor de behandeling van genetische ziekten 1 en als een technologie voor regeneratieve geneeskunde 2. In tegenstelling tot virussen die aanzienlijke veiligheidsproblemen hebben, kunnen polymère nanodeeltjes worden ontworpen als zijnde niet-toxisch, niet-immunogeen, niet-mutageen, gemakkelijker te synthetiseren, chemisch veelzijdig, die in staat groter nucleïnezuur lading en biologisch afbreekbare en / of ecologisch reageren. Kationische polymeren zelf-assembleren met negatief geladen DNA via elektrostatische interactie complexen in de orde van 100 nm die vaak worden genoemd polymère nanodeeltjes vormen. Voorbeelden van biomaterialen gebruikt nanoschaal polykationische genafgifte nanodeeltjes vormen omvatten polylysine, polyphosphoesters, poly (amidoamines) s en polyethyleenimine (PEI), een niet-afbreekbare off-the-shelf kationische polymeer gebruikt voor nucleïnezuurafleverende 1,3. Poly (beta-aminoester) s (PBAEs) zijn een nieuwe klasse van kationische polymeren die hydrolytisch 4 afbreekbaar 5,6 en zijn effectief gebleken bij genoverdracht naar moeilijk te transfecteren celtypes zoals humane endotheelcellen retinale (HRECs) 7, muizen mammaire epitheelcellen 8, menselijk hersenkankercellen 9 en macrovasculaire (humane navelstreng, HUVECs) endotheelcellen 10.
Een nieuw protocol bij polymere nanodeeltjes gebruik te maken van nanodeeltjes tracking analyse (NTA) te karakteriseren wordt beschreven. In deze benadering worden zowel de deeltjesgrootteverdeling en de verdeling van het aantal plasmiden per deeltje verkregen 11. Daarnaast wordt een high-throughput 96-well plaat transfectie assay voor snelle screening van de transfectie efficiëntie van polymeer nanodeeltjes gepresenteerd. In dit protocol, poly (beta-amino ester) s (PBAEs) worden gebruikt als model polymeren en menselijke retinale endotheelcellen (HRECs) worden gebruikt als model menselijke cellen. Dit protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan elk polymeer nanodeeltjes en elk celtype plaats in een multi-well plaat formaat evalueren.
De bepaling van het aantal plasmiden gecomplexeerd per nanodeeltjes belangrijk te ontwerpen effectieve nanodeeltjes gebaseerde gentherapie strategieën, vooral voor co-levering van meerdere plasmiden in dezelfde cel doel, zoals vaak vereist in stamcellen herprogrammering studies 12. Verschillende manieren om het aantal plasmiden geassocieerd met een nanodeeltje bepalen zijn beschreven, en elke benadering heeft nadelen in de technieken voor schatting 13-16. Quantum dot (QD) labeling gecombineerd met TEM wordt gebruikt om plasmiden per deeltje schatten chitosan gebaseerde nanopartikels. Deze schatting QD techniek gecompliceerd door de noodzaak om de DNA dat daarvan kunnen veranderen zelfassemblage labelen, de mogelijkheid dat ingekapselde ongelabelde DNA niet direct gedetecteerd; mogelijke overlap plasmiden en QDs in de 2D TEM beelden van deeltjes en andere vereenvoudigende veronderstellingen 13. Een alternatieve benadering is dat eenpplicable besteld microdomeinen aanwezig in de deeltjes is gebruikt om Lipopolyamine-DNA complexen via cryo-transmissie-elektronenmicroscopie (cryo-TEM), X-ray scattering en dynamische lichtverstrooiing (DLS) 14,15 bestuderen. Helaas materialen zoals de polymere nanodeeltjes hier onderzochte niet van toepassing bij deze methode. . In een andere studie, Collins et al gebruikt een stroom deeltjes beeldanalysetechniek bestuderen (Lys) 16 bevattend peptide / DNA complexen, maar de methode kan alleen beoordelen grotere micron-deeltjes 16. Zo hebben we onlangs een nieuwe en flexibele bepaling van het aantal plasmiden nanodeeltjes 11 kwantificeren.
De protocollen hierboven beschreven methoden voor de transfectie efficiëntie van nanodeeltjes formuleringen, alsmede een manier om de deeltjesgrootte en DNA laden van de nanodeeltjes te karakteriseren. Het aantal plasmiden per deeltje is een belangrijke parameter die kan helpen bij het voorspellen van de effectiviteit van het deeltje en kan ook worden gebruikt voor dosisbepaling. Nanodeeltjes tracking analyse kan worden uitgevoerd in een aantal verschillende waterige oplossingen, zoals verschillen in zoutconcentratie. …
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken de TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) en NIH R21CA152473 voor ondersteuning.
Reagent | |||
Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
Materials | |||
Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
NS500 | Nanosight | NA |