Valutazione della consegna del gene polimerici Nanoparticelle per l'analisi delle nanoparticelle Monitoraggio e High-throughput Citometria a Flusso
Summary
Un protocollo per l'analisi delle nanoparticelle di monitoraggio (NTA) e high-throughput citometria a flusso per valutare nanoparticelle polimeriche consegna del gene è descritto. NTA è utilizzato per caratterizzare la distribuzione delle particelle nanoparticelle dimensioni e la distribuzione delle particelle per plasmide. High-throughput citometria a flusso consente quantitativa valutazione di efficacia di trasfezione per una libreria di biomateriali di consegna del gene.
Abstract
Non virale trasferimento genico utilizzando nanoparticelle polimeriche è emerso come un approccio interessante per la terapia genica per trattare malattie genetiche 1 e come una tecnologia per la medicina rigenerativa 2. A differenza dei virus, che hanno notevoli problemi di sicurezza, nanoparticelle polimeriche possono essere progettati per essere non tossico, non immunogenica, non mutagena, più facile da sintetizzare chimicamente versatile, in grado di trasportare più carichi di acido nucleico e biodegradabili e / o l'ambiente reattivo. Polimeri cationici auto-assemblano con DNA carico negativamente tramite interazione elettrostatica per formare complessi dell'ordine di 100 nm, che sono comunemente denominate nanoparticelle polimeriche. Esempi di biomateriali utilizzati per formare nanoscala policationici nanoparticelle di consegna del gene includono polilisina, polyphosphoesters, poli (amidoamines) s e polietilenimmina (PEI), che è un non-degradabile off-the-shelf polimero cationico comunemente utilizzato per la consegna di acido nucleico 1,3. Poli (beta-amminoestere) s (PBAEs) sono una nuova classe di polimeri cationici 4 che sono idroliticamente degradabili 5,6 e hanno dimostrato di essere efficace nel gene delivery a hard-trasfezione tipi cellulari quali cellule endoteliali retiniche (HRECs) 7, topo cellule epiteliali mammarie 8, cervello umano cellule tumorali 9 e macrovascolari (vena ombelicale umana, HUVEC), cellule endoteliali 10.
Un nuovo protocollo per caratterizzare nanoparticelle polimeriche che utilizzano l'analisi delle nanoparticelle di monitoraggio (NTA) è descritto. In questo approccio, sia la distribuzione della dimensione delle particelle e la distribuzione del numero di plasmidi per particella si ottengono 11. Inoltre, un elevato throughput a 96 pozzetti per saggio di transfezione piastra screening rapido dell'efficacia trasfezione di nanoparticelle polimeriche è presentato. In questo protocollo, poli (beta-ammino estere) s (PBAEs) sono usati come modello polimeri e cellule retiniche umane endoteliali (HRECs) sono usati come modEL cellule umane. Questo protocollo può essere facilmente adattato per valutare qualsiasi nanoparticella polimerica e qualsiasi tipo di cellule in un multi-pozzetto formato lastra.
Introduction
La determinazione del numero di plasmidi complessati per nanoparticelle è importante progettare nanoparticelle efficaci strategie basate consegna del gene, in particolare per co-fornitura di plasmidi multipli al bersaglio stessa cella, come spesso è richiesto in cellule staminali riprogrammazione studi 12. Alcuni approcci per calcolare il numero di plasmidi associati a una singola nanoparticella sono stati descritti, e ogni approccio ha degli inconvenienti nelle tecniche utilizzate per la stima 13-16. Quantum dot (QD) etichettatura combinata con TEM è stato utilizzato per stimare plasmidi per particella in chitosano base di nanoparticelle. Stima con questa tecnica QD è complicato a causa della necessità di etichettare il DNA, che potrebbero alterarne le proprietà auto-assemblaggio, la possibilità che incapsulato DNA non marcato non è direttamente rilevato; plasmidi potenzialmente sovrapposti e QDs nelle immagini TEM 2D di particelle, e altre ipotesi semplificatrici 13. Un approccio alternativo, che è unApplicabile quando microdomini ordinati esistono in particelle è stato utilizzato per studiare Lipopolyamine-DNA mediante crio-microscopia elettronica a trasmissione (crio-TEM), X-ray scattering e light scattering dinamico (DLS) 14,15. Purtroppo, materiali come le nanoparticelle polimeriche esaminati qui non sono applicabili in questo metodo. . In un altro studio, Collins et al utilizzata una particella flusso tecnica di analisi di immagine per studiare (Lys) 16-peptide contenente / DNA, tuttavia, il metodo può valutare, grandi dimensioni micron particelle 16. Così, abbiamo recentemente messo a punto un nuovo metodo di analisi e flessibile per quantificare il numero di plasmidi nanoparticelle per 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli sopra descrivono metodi di valutazione dell'efficacia trasfezione di formulazioni di nanoparticelle, così come un modo per caratterizzare la dimensione delle particelle e caricamento DNA delle nanoparticelle. Il numero di plasmidi per particella è un parametro importante che può aiutare a prevedere l'efficacia della particella e può essere utilizzato anche per la determinazione della dose. Monitoraggio analisi delle nanoparticelle può essere eseguita in una gamma di differenti soluzioni acquose…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano il MSCRF TEDCO (2009-MSCRFE-0098-00) e NIH R21CA152473 per il supporto.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA |
Riferimenti
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