고분자 유전자 배달에 대한 평가는 Nanoparticle 추적 분석 및 높은 처리량 유동 세포 계측법에 의해 나노 입자
Summary
nanoparticle 추적 분석 (NTA)와 고분자 유전자 전달 나노 입자를 평가하기 위해 높은 처리량 유동 세포 계측법에 대한 프로토콜이 설명되어 있습니다. NTA는 nanoparticle 입자 크기 분포와 플라스미드 당 입자 분포를 특성화하기 위해 사용됩니다. 높은 처리량 유동 세포 계측법은 유전자 전달 biomaterials의 라이브러리에 대한 양적 transfection 효율 평가를 할 수 있습니다.
Abstract
고분자 나노 입자를 사용하여 비 바이러스 성 유전자 전달은 유전 질환 1을 치료하는 유전자 치료에 대한 매력적인 접근 방식으로서 재생 의료 2 기술로 등장했다. 중요한 안전 문제가 바이러스, 달리, 고분자 나노 입자는 더 큰 핵산화물과 생분해 성 및 / 또는 환경 대응을 들고 할 수있는, 화학적으로 다양한, 합성 무독성, 비 immunogenic, 비 mutagenic, 쉽게 할 수 있도록 설계 할 수 있습니다. 양이온 폴리머는 일반적으로 고분자 나노 입자를 칭했다 아르 100 나노 미터의 순서에 복합체를 형성하기 위해 정전기 상호 작용을 통해 부정적인 요금이 부과 DNA와 자기 조립. nanoscale polycationic 유전자 전달 나노 입자를 형성하는 데 사용 biomaterials의 예로는 비 degradable 재고품입니다 polylysine, polyphosphoesters, 폴리 (amidoamines) s와 polyethylenimine (PEI)를 포함 일반적으로 핵산 전달 1,3에 사용되는 양이온 폴리머. 폴리 (베타 – 아미노에스테르) S (PBAEs)는 5,6 hydrolytically degradable이며, 인간의 망막 내피 세포 (HRECs) 7과 같은 어려운 transfect 세포 유형에 대한 유전자 전달에 효율적으로 표시되어 양이온 폴리머 4의 최신 수업 마우스 유방 상피 세포 8, 인간의 뇌 암 세포 9 및 10 macrovascular (인간 배꼽 정맥, HUVECs) 내피 세포.
nanoparticle 추적 분석 (NTA)를 활용 한 고분자 나노 입자를 특성화 할 수있는 새로운 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 방법에서 입자 크기 분포와 입자 당 plasmids의 수 분포 모두 11 얻을 수 있습니다. 또한, 고분자 나노 입자의 transfection 효율의 급속한 진단을위한 높은 처리량 96 – 웰 플레이트 transfection 분석이 제공됩니다. 이 프로토콜에서는 폴리 (베타 – 아미노 에스테르) S (PBAEs)이 모델 고분자와 인간 망막 내피 세포 (HRECs)로 사용되는은 MO로 사용됩니다델 인간의 세포. 이 프로토콜은 쉽게 고분자 nanoparticle 및 멀티뿐만 판 형식에 대한 관심의 세포 유형을 평가하도록 구성 할 수 있습니다.
Introduction
nanoparticle 당 complexed plasmids의 수의 결정은 특히 동일한 셀 대상에 대해 여러 plasmids의 공동 제공을위한 효과적인 nanoparticle 기반의 유전자 전달 전략을 설계,하는 것이 중요합니다, 등은 종종 연구 12 재 프로그래밍 줄기 세포에 필요합니다. 하나의 nanoparticle과 관련된 plasmids의 수를 계산하는 몇 가지 방법이 설명, 각 접근 방식은 추정 13-16에 사용되는 기술의 단점을 가지고있다되었습니다. TEM과 결합 양자 점 (QD) 라벨은 키토산 기반의 나노 입자에 입자 당 plasmids를 추정하는 데 사용되었습니다. 캡슐화 라벨이없는 DNA가 직접 감지되지 않는 가능성; 잠재적으로 중복 plasmids과 입자의 2D TEM 이미지에서 QDs,이 QD 기술을 추정 인해 그 자체 조립 속성을 변경할 수있는 DNA를 레이블 할 필요에 복잡하고 다른 단순화 가정 13. 이 대안 접근 방식pplicable 주문 microdomains의 입자에 존재하면 cryo – 전송 전자 현미경 (cryo-TEM), X-선 산란, 및 동적 광 분산 (DL을) 14,15을 통해 Lipopolyamine-DNA 단지를 연구하는 데 사용되었습니다. 불행하게도, 이러한 여기 조사 고분자 나노 입자 등의 자료는이 방법으로 적용되지 않습니다. . 그러나, 그들의 방법은 큰, 마이크론 크기의 입자 16 평가할 수 있습니다, 또 다른 연구에서, 콜린스 외 공부하는 흐름 입자 이미지 분석 기술 (LYS) 16 – 포함 펩타이드 / DNA 복합체를 사용했습니다. 따라서, 우리는 최근에 nanoparticle 11 당 plasmids의 수를 수량화 할 수있는 소설하고 유연한 분석을 개발했습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
위의 프로토콜 nanoparticle 공법의 transfection 효율뿐만 아니라 입자 크기와 나노 입자의 DNA 로딩을 특성화 할 수있는 방법을 평가하는 방법을 설명합니다. 입자 당 plasmids의 수는 입자의 효과를 예측 할 수 있습니다 중요한 매개 변수이며, 또한 용량 결정에 사용할 수 있습니다. Nanoparticle 추적 분석 등 소금 농도에 차이가있는 등 다양한 수성 솔루션의 범위에서 수행 할 수 있습니다. 종종이 특성은 생…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자 지원 TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE – 0098-00)와 NIH R21CA152473 감사드립니다.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA |
Riferimenti
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