Polimerik Gen Taşıyıcı Değerlendirilmesi Nanoparçacık İzleme Analizi ve Yüksek throughput Flow Sitometri tarafından Nanopartiküller
Summary
Nanoparçacık izleme analizi (NTA) ve polimerik gen teslimat nanopartiküller değerlendirmek için high-throughput Akım sitometri için bir protokol tanımlanmıştır. NTA nanoparçacık parçacık büyüklüğü dağılımı ve plazmid başına parçacık dağılımını karakterize etmek için kullanılmaktadır. Yüksek throughput flow sitometri gen teslimat biyomalzemelerin bir kütüphane için nicel transfeksiyon etkinliği değerlendirilmesini sağlar.
Abstract
Polimerik nano partiküller kullanarak Sigara viral gen teslimat genetik hastalıklar 1. tedavisinde gen tedavisi için cazip bir yaklaşım olarak ve rejeneratif tıp 2 için bir teknoloji olarak ortaya çıkmıştır. Önemli güvenlik sorunları var virüsler, aksine, polimerik nano partiküller büyük nükleik asit kargo ve biyolojik olarak parçalanabilen ve / veya çevreye duyarlı taşıma kapasitesine sahip, kimyasal olarak çok yönlü, sentezlemek için non-toksik, non-immünojen olmayan mutajenik, daha kolay olması için dizayn edilebilir. Katyonik polimerler yaygın polimerik nano partiküller olarak adlandırılır 100 nm sırasına komplekslerini oluşturmak için elektrostatik etkileşim yoluyla negatif yüklü DNA ile kendi kendine monte. Nano ölçekli polikatyonik gen aktarımı nanopartikülleri oluşturmak için kullanılan biyomateryaller örnekleri arasında bir non-parçalanabilir off-the-shelf bir polilisin, polyphosphoesters, poli (amidoamines) s ve polietilenimin (PEI), yaygın olarak bulunur nükleik asit aktarımı ile 1,3 kullanılan katyonik polimer. Poli (beta-Aminoester) s (PBAEs), 5,6 hidrolitik olarak parçalanabilir olan ve bu tür insan retina endotel hücreleri (HRECs) 7 gibi sert-transfekte hücre tipleri için gen aktarımının etkili olduğu gösterilmiş olan katyonik polimerler 4 yeni bir sınıfıdır fare meme epitel hücreleri 8, insan beyninin kanser hücreleri 9 ve 10 makrovasküler (insan umbilikal ven, HUVEC'lere) endotel hücreleri.
Nanoparçacık izleme analizi (NTA) kullanılarak polimer nanopartikülleri karakterize etmek için yeni bir protokol tarif edilmektedir. Bu yaklaşıma göre, partikül büyüklük dağılımı ve parçacık başına plazmid sayısı dağılım hem de 11 elde edilir. Buna ek olarak, polimer nanopartikülleri ile transfeksiyon etkinliğinin hızlı taranması için olan bir yüksek verimli 96-plaka transfeksiyon deneyinde sunulmuştur. Bu protokol, poli (beta-amino ester) s (PBAEs) model polimerler ve insan retina endotel hücreleri (HRECs) olarak kullanılır mo olarak kullanılmaktadırdel insan hücreleri. Bu protokol, kolayca herhangi bir polimerik nanoparçacık ve bir multi-plaka biçiminde ilgi herhangi bir hücre tipi değerlendirmek için adapte edilebilir.
Introduction
Nanoparçacık başına komplekslenmiş plazmid sayısının belirlenmesi, özellikle de aynı hedef hücre için birden çok plazmit ortak dağıtımı için etkili nanoparçacık tabanlı bir gen aktarım stratejilere tasarlamak için önemli olan, sıklıkta çalışmaları 12 yeniden programlanması kök hücre gereklidir. Tek bir nanoparçacık ile ilişkili plazmid sayısını hesaplamak için birkaç yaklaşım tarif edilmiştir ve her bir yaklaşım tahmin 13-16 için kullanılan teknikler de dezavantajları vardır edilmiştir. TEM ile birlikte Kuantum nokta (QD) etiketleme kitosan tabanlı nanopartiküller parçacık başına plazmidler tahmin etmek için kullanılır olmuştur. Kapsüllü etiketsiz DNA doğrudan tespit edilememesi olasılığı;; potansiyel örtüşen plazmidler ve parçacıkların 2D TEM görüntülerde QDS; Bu QD teknik ile Kestirimi nedeniyle kendinden montaj özelliklerini değiştirebilir DNA, etiketlemek için ihtiyaç karmaşık ve Diğer basitleştirici kabuller 13. Bir alternatif bir yaklaşımpplicable sipariş microdomains parçacıklar mevcut olduğunda kriyo-transmisyon elektron mikroskobu (kriyo-TEM), X-ışını saçılması ve dinamik ışık saçılımı (DLS) 14,15 aracılığıyla Lipopolyamine-DNA kompleksleri incelemek için kullanılır olmuştur. Ne yazık ki, bu tür araştırmak burada polimer nanopartikülleri gibi malzemeler bu yöntem ile uygulanabilir değildir. . Ancak, kendi yöntemi sadece büyük, mikron boyutlu parçacıklar 16 değerlendirebilir; başka bir çalışmada, Collins ve ark çalışmak için bir akış parçacık görüntü analizi tekniği (Lys) 16-içeren peptid / DNA kompleksleri kullanılır. Böylece, son zamanlarda nanoparçacık 11 başına plazmit sayısı ölçmek için bir roman ve esnek analiz geliştirilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Yukarıdaki protokol nanoparçacık formülasyonların transfeksiyon etkinliği gibi parçacık boyutu ve nanoparçacıkların DNA yükleme karakterize etmek için bir yöntem değerlendirme yöntemleri açıklanmaktadır. Parçacık başına plazmit sayısı parçacık etkisini tahmin yardımcı olabilir önemli bir parametre olan ve aynı zamanda doz tayini için kullanılabilir. Nanopartikül izleme analizi, tuz konsantrasyonunun farklı olanlar gibi çeşitli sulu çözeltiler, bir dizi içinde gerçekleştirilebili…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar destek için TEDCO MSCRF (2009-MSCRFE-0098-00) ve NIH R21CA152473 ederim.
Materials
| Reagent | |||
| Phosphate Buffered Saline, 1x (PBS) | Invitrogen | 10010 | |
| EGM-2MV BulletKit | Lonza | CC-3202 | |
| Trypsin | Invitrogen | 25300 | |
| Sodium acetate buffer | Sigma-Aldrich | S7899 | Dilute to 25mM in deionized water |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 276855 | |
| pEGFP DNA | Elim Biopharmaceuticals | NA | |
| DsRed DNA | Addgene | 21718 | |
| PEI, branched | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| CellTiter 96 AQueous One | Promega | G3580 | |
| Materials | |||
| Clear flat bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Clear round bottom 96-well plate, sterile | Sarstedt | 82.1582.001 | |
| 12-channel Finnpipette | Thermo Scientific | NA | 5-50 and 50-300 μl |
| Fluorescence Microscope | Zeiss | NA | Model number: AX10 |
| C6 Accuri flow cytometer | BD Biosciences | NA | |
| HyperCyt attachment | Intellicyt | NA | |
| NS500 | Nanosight | NA |
Riferimenti
- Putnam, D. Polymers for gene delivery across length scales. Nature Materials. 5, 439-451 (2006).
- Sheyn, D., et al. Genetically modified cells in regenerative medicine and tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62, 683-698 (2010).
- Boussif, O., et al. A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 7297-7301 (1995).
- Green, J. J. Rita Schaffer Lecture: Nanoparticles for Intracellular Nucleic Acid Delivery. Ann. Biomed. Eng. 40, 1408-1418 (2011).
- Lynn, D. M., Langer, R. Degradable poly(beta-amino esters): Synthesis, characterization, and self-assembly with plasmid DNA. J. Am. Chem. Soc. 122, 10761-10768 (2000).
- Sunshine, J. C., Peng, D. Y., Green, J. J. Uptake and transfection with polymeric nanoparticles are dependent on polymer end-group structure, but largely independent of nanoparticle physical and chemical properties. Mol. Pharm. , (2012).
- Shmueli, R. B., Sunshine, J. C., Xu, Z., Duh, E. J., Green, J. J. Gene delivery nanoparticles specific for human microvasculature and macrovasculature. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. , (2012).
- Bhise, N. S., et al. The relationship between terminal functionalization and molecular weight of a gene delivery polymer and transfection efficacy in mammary epithelial 2-D cultures and 3-D organotypic cultures. Biomaterials. 31, 8088-8096 (2010).
- Tzeng, S. Y., et al. Non-viral gene delivery nanoparticles based on poly(beta-amino esters) for treatment of glioblastoma. Biomaterials. 32, 5402-5410 (2011).
- Sunshine, J., et al. Small-Molecule End-Groups of Linear Polymer Determine Cell-Type Gene-Delivery Efficacy. Adv. Mater. 21, 4947 (2009).
- Bhise, N. S., Shmueli, R. B., Gonzalez, J., Green, J. J. A novel assay for quantifying the number of plasmids encapsulated by polymer nanoparticles. Small. 8, 367-373 (2012).
- Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
- Ho, Y. P., Chen, H. H., Leong, K. W., Wang, T. H. Evaluating the intracellular stability and unpacking of DNA nanocomplexes by quantum dots-FRET. Journal of Controlled Release: Official journal of the Controlled Release Society. 116, 83-89 (2006).
- Kreiss, P., et al. Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Research. 27, 3792-3798 (1999).
- Pitard, B., et al. Virus-sized self-assembling lamellar complexes between plasmid DNA and cationic micelles promote gene transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 14412-14417 (1997).
- Collins, L., Kaszuba, M., Fabre, J. W. Imaging in solution of (Lys)(16)-containing bifunctional synthetic peptide/DNA nanoparticles for gene delivery. Biochimica et Biophysica Acta. 1672, 12-20 (2004).
- Green, J. J., et al. Biodegradable polymeric vectors for gene delivery to human endothelial cells. Bioconjug. Chem. 17, 1162-1169 (2006).
