En Orthotopic blåscancer modell för Gene Delivery Studier

Summary

Implantering av cancerceller in i ursprungsorgan kan fungera som en användbar preklinisk modell för att utvärdera nya terapier. MB49 blåsa cancerceller kan odlas i urinblåsan efter intravesikal instillation. Detta protokoll visar kateterisering av musen blåsan för att tumörimplantation och adenoviral leverans.

Abstract

Urinblåsecancer är den näst vanligaste cancerformen i den urogenitala kanalen och nya behandlingsmetoder som kan minska återfall och progression behövs. Tumormicroenvironmenten kan avsevärt påverka tumörutveckling och terapisvar. Därför är det ofta önskvärt att odla tumörceller i det organ från vilka de har sitt ursprung. Detta protokoll beskriver en orthotopic modell av cancer i urinblåsan, där MB49 murina blåskarcinom celler ingjutit in i urinblåsan via kateter. Framgångsrik tumörcells implantation i denna modell kräver avbrott i det skyddande glykosaminoglykan skiktet, vilket kan åstadkommas genom fysikaliska eller kemiska medel. I våra protokoll blåsan behandlas med trypsin före cellinstillation. Kateterisering av blåsan kan också användas för att leverera terapeutiska medel när tumörerna är etablerade. Detta protokoll beskriver leverans av en adenoviral konstrukt som uttrycker en luciferas reportergen. Medan our protokoll har optimerats för korttidsstudier och fokuserar på genen leverans, har metodiken för musen blåsan kateterisering breda applikationer.

Introduction

Urinblåsecancer är den näst vanligaste cancerformen i den urogenitala kanalen med nästan 75.000 nya fall och 15.000 dödsfall som förväntas under 2012 ^1. Hög frekvens av återfall kräver livslång uppföljning, vilket gör blåscancer en av de mest kostsamma cancer att behandla. Cancer i urinblåsan som har invaderat muskeln skiktet kan metastasera till lever, lunga eller ben via det lymfatiska systemet. Multimodal behandling av avancerade tumörer resulterar i endast 20-40% överlevnad efter 5 år. Därför finns ett stort behov effektiva behandlingsstrategier för att minska återfall och progression av ytlig blåscancer och förbättra terapeutiska resultat hos patienter med avancerad sjukdom.

Utveckling av nya läkemedel krävs prekliniska modeller för att utvärdera effekten efter inledande in vitro-utvärdering. Tumormicroenvironmenten kan avsevärt påverka cancerutveckling och lyhördhet, vilket understryker behovet av preclinical modeller där tumörer uppstår eller kan fastställas i det organ i ursprung. Ett tillvägagångssätt är att utveckla transgena modeller i vilka tumörer uppstå spontant eller kan induceras i en organspecifikt sätt. En utmärkt protokoll av en transgen blåscancer modell har nyligen publicerats ^2. Nackdelen med transgena modeller är att tumörer tenderar att utvecklas långsamt och med mindre enhetlighet än önskat. Dessutom har kostnaden för att upprätthålla en avelskoloni vägas. Ett alternativ till transgena modeller är orthotopic implantation av tumörceller, som har fördelen av korta tidsramar för tumör etablering i kommersiellt tillgängliga möss. Medan vissa humana cancer i urinblåsan cellinjer kan odlas orthotopically (vi har med framgång använt UM-UC-3), kan det vara önskvärt att upprätta tumörer i immunkompetenta möss. Två murina blåscancer cellinjer, som växer orthotopically är MBT-2 och MB49 ^3. Eftersom MBT-2-celler är förorenade med replikeratyp C retrovirus ^4, har vi valt MB49 celler för våra studier. Det är viktigt att notera att MB49-celler isolerades från en manlig mus och orthotopic implantationer är endast för anatomiska skäl utförs i honmöss. Detta har fördelen av enkel identifiering av de implanterade cellerna genom markörer på Y-kromosomen, men obalansen kön kan vara en nackdel för immunologiska studier.

Blåsan epitel kantas av en glykosaminoglykan (GAG)-skikt, som fungerar som en barriär för infektion av mikroorganismer. Denna barriär kan också störa implantation av tumörceller och ett flertal metoder har utvecklats för att övervinna denna svårighet (tabell 1). Diatermi har använts i stor utsträckning som ett fysiskt sätt att störa GAG lagret ^5-13 och ett protokoll som visar diatermi har nyligen publicerats i JUPITER ^14. Dock bör en diatermi enhet inte är tillgängliga, kemiska medel för att förstöra GAG skikt, såsom silvernitrat eller poly-L-lysin kan också användas ^{15 till 24.} Tumörer som tillsatts genom en kort exponering av blåsan till en liten volym av silvernitrat (5 till 10 | il, 0,15 till 1,0 M, ~ 10 sek) eller längre kontakt med poly-L-lysin (100 pl av 0,1 mg / ml under 20 min) (tabell 1). Här beskriver vi en metod som använder trypsin för att underlätta implantation av MB49 celler.

I ett försök att förbättra terapeutiska metoder för cancer i urinblåsan har genterapi rönt betydande uppmärksamhet. Ur klinisk synvinkel är blåscancer ett perfekt mål för genterapi på grund av lätt tillgänglighet av orgeln och förmågan att lokalt leverera nyttolasten. Virala vektorer som har utforskats för blåscancer genterapi inkluderar ett onkolytiskt herpes simplex virus ^25, retrovirus ^26, canarypoxvirus ^27, vaccinia-virus, AAV, och adenovirus ^28. I den andra delen av vår protokoll, beskriver vi en metod för viral leverans som är praktiskt taget identisk med instillation av tumörcellerna. Av intresse i vårt labb är att utveckla nya metoder för gen leverans, vilket vi bedömer via mareld med hjälp av en adenovirusvektor som uttrycker en luciferas transgen. Emellertid kan metoden i blåsan kateterisering användas för tillförsel av olika medel och har bred tillämpbarhet därför.

Protocol

Alla som deltar i djurförsök har granskats och godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid medicinska universitetet i South Carolina. Protokollet godkändes enligt USDA kategori D för smärta. 1. Cell Implantation Två dagar innan du utför proceduren, plåt 1 x 10 6 MB49 celler till T-25 kolvar. Använd hög glukos DMEM kompletterat med 10% FBS (och antibiotika, om så önskas). En kolv är tillräcklig för varje grupp av upp till fem mös…

Representative Results

Hematuri har observerats i nästan alla möss inom 8 dagar efter implantation av 200.000 MB49 celler. Såsom visas i figur 1, blåsa i vikt mer än fördubblas från 34,7 ± 3,3 mg (intervall 31 till 37 mg, n = 4) i nontumor bärande möss till 87,5 ± 19,2 mg (intervall 77 till 120 mg, n = 10) i möss som har implanterats med MB49 celler. När det gäller genen leverans, fann vi att avbildning möss 24 timmar efter virusinstillation ger en starkare signal än efter 48 timmar (Figur 2)….

Discussion

Den primära metod som beskrivs i detta protokoll är kateterisering av mus blåsor, som har breda applikationer för instillation av celler eller någon agent är avsedd för lokal leverans till epitelcellerna i urinblåsan. Den specifika protokoll som beskrivs ovan har optimerats för korttidsstudier (~ 10 dagar). Implantation det exakta antalet celler är kritisk, eftersom en högre cell nummer kommer att leda till en snabbare tumörtillväxt och eventuellt förlust av djur på grund av stor tumörbörda. Med hjälp …

Materials

Name of reagent	Company	Catalog number	Comments
6-8 week old female mice	Jackson Laboratories	Strain Name: C57BL/6J Stock Number: 000664
Trypsin*	MediaTech	MT25-053-CI	Obtained through Fisher
DMEM*	MediaTech	MT10-017-CV	Obtained through Fisher
FBS	Hyclone	SH30071.03	Heat-inactivated
T25 flasks*	Corning Costar	Corning No.:3056 Fisher: 07-200-63	Obtained through Fisher
MB49 cells	N/A	N/A	Obtained from Dr. Boehle (see reference11)
Puralube Vet Ointment*	Pharmaderm	Henry Schein Company No.:036090-6050059 Fisher: NC9676869	Obtained through Fisher
Depilatory cream: Veet	local pharmacy
Lubricant: K-Y Jelly	local pharmacy
Catheters*	Exel International	Exel International No.:26751; Fisher: 14-841-21	Obtained through Fisher
Isoflurane	Terrell	NDC 66794-011-25	Obtained though hospital pharmacy
1 ml slip tip TB syringes	Becton Dickinson	BD309659 Fisher:14-823-434
D-Luciferin	Gold Biotechnologies	L-123-1
Ad-CMV-Luc	VectorBiolabs	1000; Request large scale amplification and CsCl purification for in vivo use	Infectious agent that requires BSL2 containment
Steady-Glo Luciferase Assay System	Promega	E2510 (10 ml), E2520 (100 ml), or E2550 (10 x 100 ml)

*available through multiple vendors

EQUIPMENT

Material name	Company	Catalog number	Comments
Anesthesia system	E-Z Systems, Euthanex Corporation	Anesthesia system: EZ7000 5-port mouse rebreathing device: EZ109	Obtained through Fisher
Xenogen IVIS 200	Caliper Life Sciences	http://www.caliperls.com/products/preclinical-imaging/ivis-imaging-system-200-series.htm
FLUOstar Optima	BMG Labtech	http://www.bmglabtech.com/products/microplate-reader/instruments.cfm?product_id=2