Extensor Digitorum longus स्नायु की मांसपेशी समारोह का मूल्यांकन<em> पूर्व vivo</em> और Tibialis पूर्वकाल स्नायु<em> सीटू में</em> चूहे में
Summary
अंग मांसपेशी सिकुड़ा और निष्क्रिय यांत्रिक गुणों में परिवर्तन मांसपेशियों की बीमारियों के लिए महत्वपूर्ण biomarkers हैं. इस पांडुलिपि शारीरिक assays murine extensor digitorum longus और tibialis पूर्वकाल मांसपेशियों में इन गुणों को मापने का वर्णन करता है.
Abstract
Body movements are mainly provided by mechanical function of skeletal muscle. Skeletal muscle is composed of numerous bundles of myofibers that are sheathed by intramuscular connective tissues. Each myofiber contains many myofibrils that run longitudinally along the length of the myofiber. Myofibrils are the contractile apparatus of muscle and they are composed of repeated contractile units known as sarcomeres. A sarcomere unit contains actin and myosin filaments that are spaced by the Z discs and titin protein. Mechanical function of skeletal muscle is defined by the contractile and passive properties of muscle. The contractile properties are used to characterize the amount of force generated during muscle contraction, time of force generation and time of muscle relaxation. Any factor that affects muscle contraction (such as interaction between actin and myosin filaments, homeostasis of calcium, ATP/ADP ratio, etc.) influences the contractile properties. The passive properties refer to the elastic and viscous properties (stiffness and viscosity) of the muscle in the absence of contraction. These properties are determined by the extracellular and the intracellular structural components (such as titin) and connective tissues (mainly collagen) 1-2. The contractile and passive properties are two inseparable aspects of muscle function. For example, elbow flexion is accomplished by contraction of muscles in the anterior compartment of the upper arm and passive stretch of muscles in the posterior compartment of the upper arm. To truly understand muscle function, both contractile and passive properties should be studied.
The contractile and/or passive mechanical properties of muscle are often compromised in muscle diseases. A good example is Duchenne muscular dystrophy (DMD), a severe muscle wasting disease caused by dystrophin deficiency 3. Dystrophin is a cytoskeletal protein that stabilizes the muscle cell membrane (sarcolemma) during muscle contraction 4. In the absence of dystrophin, the sarcolemma is damaged by the shearing force generated during force transmission. This membrane tearing initiates a chain reaction which leads to muscle cell death and loss of contractile machinery. As a consequence, muscle force is reduced and dead myofibers are replaced by fibrotic tissues 5. This later change increases muscle stiffness 6. Accurate measurement of these changes provides important guide to evaluate disease progression and to determine therapeutic efficacy of novel gene/cell/pharmacological interventions. Here, we present two methods to evaluate both contractile and passive mechanical properties of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and the contractile properties of the tibialis anterior (TA) muscle.
Protocol
1. EDL स्नायु पूर्व vivo सिकुड़ा और निष्क्रिय गुण का मूल्यांकन EDL की मांसपेशी के सिकुड़ा और निष्क्रिय गुण पूर्व vivo इन विट्रो मांसपेशी परीक्षण प्रणाली में अरोड़ा वैज्ञानिक का उपयोग कर मापा जाता है. सामग्री और उपकरणों के लिए 1 टेबल देखें. 1.1 उपकरण तैयारी पानी जैकेट ऊतक स्नान oxytube हासिल करके इकट्ठा स्नान ऊतक अंग. मांसपेशी बढ़ते तंत्र स्नान के लिए इकट्ठे संलग्न. Oxytube गैस के लिए लाइन से कनेक्ट करें. पानी जैकेट ऊतक स्नान पानी संचलन लाइनों जकड़ना और स्नान के जल निकासी में सुई वाल्व जगह. घूम पानी स्नान पर मुड़ें और 30 7 ° C तापमान को समायोजित. 95% की 5 (वर्ग इंच प्रति पाउंड) साई ओ -5 2% सीओ 2 oxytube के माध्यम से प्रवाह करने की अनुमति. घंटी बफर के साथ स्नान भरें. कम से कम के लिए बफर समभार बनानाOxytube वाल्व का समायोजन करके एक स्थिर गैस के प्रवाह के साथ 10 मिनट. उपकरणों पर मुड़ें (उत्तेजक, दोहरे मोड लीवर प्रणाली, और संकेत इंटरफ़ेस). निर्माता अनुदेश के अनुसार लोड गतिशील मांसपेशियों पर नियंत्रण सॉफ्टवेयर (DMC). 1.2 EDL मांसपेशी विच्छेदन सभी जानवरों के अध्ययन संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए. 2.5 μl / चतनाशून्य करनेवाली औषधि कॉकटेल (सामग्री अनुभाग देखें) के जी शरीर के वजन के intraperitoneal इंजेक्शन के साथ माउस anesthetize. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया के दौरान बेहोश करने की क्रिया की गहराई एक पैर की अंगुली चुटकी प्रदर्शन द्वारा जाँच की थी. प्रारंभिक संवेदनाहारी खुराक के 10% के एक पूरक administrated है जब संज्ञाहरण के तहत पशु रखने के लिए आवश्यक है. पिछले अंग दाढ़ी. 37 पर शरीर कोर तापमान एक हीटिंग पैड पर माउस रखकर ° C विच्छेदन प्रक्रिया के लिए पहले बनाए रखें. शरीर का तापमान लगातार मलाशय के temperat को मापने के द्वारा नजर रखी हैएक थर्मल जांच का उपयोग कर ure. विच्छेदन बोर्ड (1 चित्रा) पर माउस लापरवाह स्थिति. पैर त्वचा बंद पील हिंद अंग की मांसपेशियों को बेनकाब करने के लिए. दो ललित पिंस, और पैर में एक gracilis मांसपेशी में अन्य का उपयोग sylgard ब्लॉक पर पैर सुरक्षित. 37 पर मुख्य शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए माउस शरीर के ऊपर एक गर्मी दीपक जगह डिग्री सेल्सियस लगातार घंटी बफर के साथ सभी उजागर मांसपेशियों superfuse. एक वैक्यूम लाइन के माध्यम से अतिरिक्त बफर नाली. बाहर का टीए पट्टा और पैर की ओर त्वचा विदारक stereomicroscope के तहत extensor बंधन बेनकाब. धीरे से टीए मांसपेशी प्रावरणी को कवर हटा दें. Extensor को बाहर टीए कण्डरा जारी बंधन कट. बाहर का टीए कण्डरा कट और यह टीए मांसपेशी दूर छील उपयोग करने के लिए. अपने समीपस्थ लगाव को ध्यान में TA मांसपेशी को हटा दें. घंटी बफर लथपथ कपास की एक पतली EDL की मांसपेशियों को अगले टुकड़ा टीए मांसपेशी vasculature का टूटना की वजह से खून बह रहा है को अवशोषित रखें. वैक्यूम लाइन का उपयोग करने के लिए अतिरिक्त बफर और रक्त को दूर करने के लिए. एक डबल वर्ग एक पाश डिस्टल EDL मांसपेशी की मांसपेशियों पट्टा (MTJ) जंक्शन (2 चित्रा) में एक रोटी रेशम सीवन का उपयोग गाँठ द्वारा पीछा किया गांठ बांध. मछलियां नितम्बास्थि समीपस्थ EDL मांसपेशी का पर्दाफाश मांसपेशी के बाहर भाग में एक चीरा बनाओ. समीपस्थ EDL कण्डरा की MTJ में समुद्री मील की एक ही सेट (2 चित्रा) से दोहराएँ. या तो समीपस्थ या एक डबल वर्ग गाँठ ही सिवनी लाइन का उपयोग कर के साथ बाहर समुद्री मील लीवर हाथ हुक संलग्न. शेष सीवन लाइन कट. समीपस्थ EDL समीपस्थ सीवन गाँठ बेहतर कण्डरा कट. हुक के साथ लिफ्ट EDL मांसपेशी और मांसपेशी नीचे vasculature में कटौती. डिस्टल EDL डिस्टल सीवन के पिछले अंग से EDL मांसपेशी को हटाने गाँठ अवर कण्डरा कट. कवर उजागर घंटी बफर लथपथ कपास का एक टुकड़ा के साथ पिछले अंग. लीवर हाथ हुक संलग्न. मांसपेशी खड़ी पंक्तिदो इलेक्ट्रोड के बीच. डिस्टल सीवन लाइन तय पोस्ट करने के लिए सुरक्षित. घंटी बफर में डूब मांसपेशी ऊतक स्नान लिफ्ट. 1.0 ग्राम के लिए आराम कर रही तनाव दोहरी अनुवाद / मोटे, ठीक मंच का उपयोग कर समायोजित और मांसपेशियों में कम से कम 10 मिनट के लिए संतुलन में लाना करने के लिए अनुमति देते हैं. 1.3 EDL की मांसपेशी के सिकुड़ा और निष्क्रिय गुण मापने तालिका 2 का प्रयोग करने के लिए निम्नलिखित मापन के प्रत्येक के लिए DMC सॉफ्टवेयर में मानकों सेट. गतिशील पेशी (डीएमए) विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण. 1.3.1 EDL की मांसपेशी के सिकुड़ा गुणों को मापने EDL मांसपेशी अलावा 60 सेकंड के साथ 150 हर्ट्ज से कम तीन बार 8 मांसपेशी को स्थिर करने के लिए उत्तेजित. अलग आराम कर रही तनाव में EDL मांसपेशी को प्रोत्साहित करने के लिए इष्टतम लंबाई (लो) निर्धारित है. इष्टतम लंबाई जो लंबाई में पेशी अधिकतम चिकोटी तनाव विकसित है. मांसपेशी की अनुमति दें2 मिनट के लिए आराम. समायोजित तनाव आराम कर लो. एकल चिकोटी उत्तेजना में मांसपेशियों की शक्ति को मापने. पूर्ण चिकोटी बल (पं.), शिखर (टीपीटी) के तनाव और आधे पंडित के विश्राम का समय (आरटी साढ़े) करने के लिए समय का निर्धारण करते हैं. पेशी 2 मिनट के लिए आराम करने की अनुमति दें. समायोजित तनाव आराम कर लो. धनुस्तंभीय मांसपेशी अलग उत्तेजना आवृत्तियों (50, 80, 100, 120, 150, और 200 हर्ट्ज) में उत्पन्न बल उपाय. निरपेक्ष अधिकतम धनुस्तंभीय मांसपेशी बल (पीओ) जहां मांसपेशी बल अधिक से अधिक तक पहुँचता है निर्धारित करते हैं. TPT और साढ़े 9 पो की आरटी उपाय. पेशी 5 मिनट के लिए आराम करने की अनुमति दें. समायोजित तनाव आराम कर लो. 2 चक्रों के बीच मिनट बाकी के साथ सनकी संकुचन की 10 चक्र लागू करें. सनकी संकुचन के प्रत्येक चक्र के बाद पो के सापेक्ष बल हानि की गणना. EDL मांसपेशी तंत्र से अलग और सिवनी साइट पर tendons में कटौती. निर्धारित मांसपेशी गीला वजन और मांसपेशी पार अनुभागीय क्षेत्र (सीएसए) की गणना6,10. 1.3.2 EDL की मांसपेशी के निष्क्रिय गुणों को मापने Contralateral EDL पेशी काटना और तंत्र के लिए यह 1.2 धारा में वर्णित के रूप में देते हैं, 2 से 7 कदम. एक छह कदम खींच प्रोटोकॉल जहां मांसपेशी 10% लो की एक वेतन वृद्धि के साथ 160% लो तनावपूर्ण है EDL मांसपेशी विषय. प्रोफ़ाइल तनाव तनाव 6 विश्लेषण. चोटी से 0.1s बाद पीक (पीपी), 0.1 से 0.2s: निम्नलिखित समय फ्रेम में खींच और पकड़े हुए 10% लो में पेशी के बाद तनाव छूट दर (SRR) को मापने के द्वारा EDL की मांसपेशी के चिपचिपा संपत्ति का मूल्यांकन 0.2 के लिए 0.5s पीपी से 0.5 से 1s पीपी और 1 से 1.5s पीपी पीपी, अध्ययन के अंत में, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था और / या कत्ल से माउस euthanize है जबकि माउस संज्ञाहरण के तहत अब भी है. EDL मांसपेशी तंत्र से अलग और सिवनी साइट पर tendons में कटौती. निर्धारित मांसपेशी गीला वजन और मांसपेशी पार से की गणनाctional क्षेत्र (सीएसए) 6, 10. 2. स्वस्थानी में प्रादेशिक सेना की मांसपेशी के सिकुड़ा गुण का मूल्यांकन प्रादेशिक सेना की मांसपेशी के सिकुड़ा गुणों स्वस्थानी मांसपेशी परीक्षण प्रणाली में अरोड़ा वैज्ञानिक का उपयोग कर मापा जाता है. सामग्री और उपकरणों के लिए 1 टेबल देखें. 2.1 उपकरण तैयारी 37 करने के लिए पशु thermo नियंत्रित चरण गर्मी ° C घूम पानी स्नान का उपयोग. उपकरणों पर मुड़ें (उत्तेजक, दोहरे मोड लीवर प्रणाली, और संकेत इंटरफ़ेस). निर्माता अनुदेश के अनुसार DMC सॉफ्टवेयर लोड. स्वस्थानी बल माप में 2.2 टीए मांसपेशी की तैयारी माउस anesthetize, पिछले अंग दाढ़ी और टीए मांसपेशी का पर्दाफाश के रूप में चरण 1 में 3 से 1.2 धारा में वर्णित है. वुटने की चक्की बंध उसी के आसपास एक डबल वर्ग गाँठ बाँधएनजी एक रोटी रेशम सीवन. एक डबल वर्ग गाँठ बाँध डिस्टल टीए मांसपेशी की MTJ (2 चित्रा) में एक पाश गाँठ द्वारा पीछा करने के लिए, एक डबल वर्ग डिस्टल टीए कण्डरा गाँठ ही सिवनी लाइन का उपयोग कर से एक ~ 10 मिमी पाश छोड़ने गाँठ बाँध. पाश की तरफ 2 डबल वर्ग गाँठ रखें. पिछले अंग से पिन निकालें और पशु प्रवण स्थिति. मछलियां नितम्बास्थि मांसपेशी बेनकाब. Sciatic तंत्रिका प्रकट midline में एक चीरा बनाओ. Sciatic तंत्रिका की समीपस्थ अंत के आसपास एक डबल वर्ग गाँठ बाँध. सीवन लाइनों की एक तरफ छाँटो और गांठ को बेहतर तंत्रिका में कटौती. धीरे, sciatic तंत्रिका सीवन लाइन का उपयोग कर घुटने की ओर खींचने के लिए और स्पष्ट आसपास मुक्त संयोजी ऊतक ~ इसकी लंबाई 5 मिमी. इस प्रक्रिया के दौरान खिंचाव मत तंत्रिका और लगातार घंटी बफर के साथ तंत्रिका superfuse. Contralateral टीए के रूप में चरण 1 में 3 से वर्णित मांसपेशियों तैयार. री का एक टुकड़ा के साथ एक उजागर हिंद अंग के कवरnger बफर कपास लथपथ. लगातार पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) घंटी बफर के साथ दोनों हिंद अंग superfuse. एक वैक्यूम लाइन के माध्यम से अतिरिक्त बफर निकालें. स्थिति पशु मंच पर प्रवण पशु. पशु मंच घुटने क्लैंप धारक संलग्न और डबल वुटने की चक्की बंधन सीवन लाइनों का उपयोग वर्ग गांठ के साथ धातु पिन दोनों घुटनों सुरक्षित. Sylgard ललित पिन का उपयोग ब्लॉक पर दोनों पैर पिन. Thermo नियंत्रित स्तर पर पशु मंच सुरक्षित. 37 डिग्री सेल्सियस में जानवर मूल शरीर के तापमान को बनाए रखने के लिए गर्मी दीपक स्थिति पशु मंच इलेक्ट्रोड धारक सुरक्षित और सीवन लाइन का उपयोग कर इलेक्ट्रोड पर sciatic तंत्रिका करना. इलेक्ट्रोड पिछले अंग की मांसपेशियों से दूर रखो. MTJ सिवनी साइट पर खुला हिंद अंग के बाहर का टीए कण्डरा काटें. लीवर हाथ हुक करने के लिए बाहर का टीए कण्डरा सीवन पाश संलग्न. एक गर्म घंटी बफर लथपथ कपास के साथ कवर हिंद अंग मांसपेशी उजागर. <p class="jove_step"> 2.3 प्रादेशिक सेना की मांसपेशी के सिकुड़ा गुणों को मापने तालिका 2 का उपयोग करने के लिए DMC सॉफ्टवेयर में मानकों सेट. प्रादेशिक सेना की मांसपेशी के सिकुड़ा गुणों का निर्धारण एक ही धारा 1.3.1 में वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करें. विश्लेषण डेटा DMA सॉफ्टवेयर का उपयोग कर. सिकुड़ा संपत्ति माप के बाद, डिस्टल leveler हाथ हुक से टीए कण्डरा सीवन पाश अलग. टीए मांसपेशी निकालें. मांसपेशी गीला वजन निर्धारित और सीएसए की गणना 10. चरण 1 से 3 ऊपर वर्णित के अनुसार contralateral टीए मांसपेशी के सिकुड़ा गुणों उपाय. अध्ययन के अंत में संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार माउस euthanize.
Representative Results
निम्नलिखित परिणाम हमारे पिछले 6,9 रिपोर्टों से प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. डेटा मतलब है की त्रुटि मतलब ± मानक के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं तालिका 3 सामान्य BL10 और dystrophin की कमी (MDX) उम्र के 4 से 6 महीने में चूहों में EDL की मांसपेशी के morphometric गुणों से पता चलता है. चित्रा 4 के प्रतिनिधि सिकुड़ा और निष्क्रिय गुणों से पता चलता है BL10 और MDX चूहों से EDL मांसपेशी. EDL की मांसपेशी के सिकुड़ा गुण विशिष्ट (निरपेक्ष CSA द्वारा विभाजित बल) चिकोटी बल (4A चित्रा), विशिष्ट अधिकतम धनुस्तंभीय बल (4B चित्रा), TPT और आधा पूर्ण अधिकतम धनुस्तंभीय बल के आर टी सहित निम्नलिखित नियम द्वारा वर्णित हैं (चित्रा 4C और डी). TPT और आधा आरटी भी पूर्ण चिकोटी बल से गणना कर सकते हैं. तनाव तनाव (चित्रा 4E) प्रोफाइल और SRR (चित्रा 4F) एकफिर EDL की मांसपेशी के निष्क्रिय गुणों का वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. Dystrophin की अनुपस्थिति EDL 6,9 मांसपेशी के सिकुड़ा और निष्क्रिय गुणों पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है. विशिष्ट चिकोटी और धनुस्तंभीय बलों MDX EDL मांसपेशी में काफी कम कर रहे हैं. TPT काफी तेज है, जबकि आधा आरटी काफी MDX EDL मांसपेशी में धीमी है. प्रोफाइल तनाव तनाव का पता चलता है कि कठोरता MDX EDL मांसपेशी में काफी वृद्धि हुई है. MDX EDL मांसपेशी भी शिखर तनाव तक पहुँचने से पहले एक काफी ज्यादा उच्च प्रतिरोध बल (निष्क्रिय तनाव) पैदावार, जबकि बाद पीक तनाव को अस्वीकृत करते बहुत तेजी से. इसके अलावा, SRR MDX EDL मांसपेशी में काफी उच्च BL10 EDL मांसपेशी की तुलना में था. सांख्यिकीय विश्लेषण दो समूहों के बीच सांख्यिकीय महत्व टी परीक्षण छात्र द्वारा विश्लेषण किया है. एस के लिएकई समूहों के बीच tatistical महत्व है, एक तरह से या दो तरह एनोवा Bonferroni पोस्ट अस्थायी विश्लेषण से बाद विश्लेषण SAS सॉफ्टवेयर (एसएएस संस्थान इंक, Cary, नेकां) का उपयोग करने की सिफारिश की है. जब पी <0.05 अंतर महत्वपूर्ण माना जाता है. 1 टेबल सामग्री और उपकरण. प्रयोग आराम कर तनाव (ग्राम) पल्स आवृत्ति (हर्ट्ज) पल्स चौड़ाई (एमएस) उत्तेजना अवधि (एमएस) खींचो लंबाई खींचो अवधि (एमएस) खींचो दर टिप्पणियां 1. EDL मांसपेशी पूर्व vivo सिकुड़ा और निष्क्रिय गुणों का मूल्यांकन 1.3.1 EDL की मांसपेशी के सिकुड़ा गुणों को मापने 1. गरम करना 1.0 150 0.2 300 प्रत्येक प्रोत्साहन के बीच 60 सेकंड के लिए मांसपेशियों को आराम दें. इन प्रारंभिक धनुस्तंभीय संकुचन बाद के मापन के लिए मांसपेशियों को स्थिर. 2. इष्टतम मांसपेशियों की लंबाई (लो) 0.5, 1.0, 1.5, और 2.0 1 0.2 300 मांसपेशी प्रत्येक प्रोत्साहन के बीच 30 सेकंड के लिए आराम करने की अनुमति दें. मांसपेशी इष्टतम लंबाई का उपयोग कर एक डिजिटल कैलिपर उपाय. 3. एकल टीडब्लूआइदर्पण बल (पं.) आराम कर रही तनाव को समायोजित करने के लिए लो 1 0.2 300 4. धनुस्तंभीय मांसपेशी बल आराम कर रही तनाव को समायोजित करने के लिए लो 50, 80, 100, 120, 150, और 200 0.2 300 मांसपेशी प्रत्येक प्रोत्साहन के बीच 1 मिनट के लिए आराम करने की अनुमति दें. आवृत्ति है कि अधिक से अधिक पूर्ण धनुस्तंभीय बल (पीओ) उत्पन्न करने का निर्धारण करते हैं. 5. सनकी संकुचन आराम कर रही तनाव को समायोजित करने के लिए लो आवृत्ति है कि अधिकतम धनुस्तंभीय बल (पीओ) उत्पन्न का उपयोग करें 0.2 700 10% लो पिछले 200 उत्तेजना अवधि के एमएस 0.5 लो / सेक चक्रों के बीच 2 मिनट बाकी के साथ 10 चक्र के लिए सनकी संकुचन को दोहराएँ. 6. EDL मांसपेशी की सीएसए </td> = CSA (मांसपेशी जन (छ) / [1.06 जी / 3 सेमी x (लो .44 x)] 1.06 जी / 3 सेमी की मांसपेशी घनत्व है और 0.44 EDL मांसपेशी फाइबर के अनुपात Lo लंबाई है. 1.3.2 EDL की मांसपेशी के निष्क्रिय गुणों को मापने 1. छह कदम खींच प्रोटोकॉल आराम कर रही तनाव को समायोजित करने के लिए लो 10% लो 2 सेमी / सेक लो तक 160% लो तक पहुँच जाता है 10% की एक वेतन वृद्धि के साथ खींच प्रोटोकॉल दोहराएँ. Alow खिंचाव के चक्र के बीच 1.5 सेकंड. 2. SRR आराम कर रही तनाव को समायोजित करने के लिए लो 10% लो 2 सेमी / सेक SSR टी के साथ तनाव में अंतर को विभाजित करके गणना की हैime एक समय सीमा में दो अंक के बीच समय गुजरे. 2.3 प्रादेशिक सेना की मांसपेशी के सिकुड़ा गुणों को मापने 1. गरम करना 4.0 150 0.2 300 प्रत्येक प्रोत्साहन के बीच 60 सेकंड के लिए मांसपेशियों को आराम दें. 2. इष्टतम मांसपेशियों की लंबाई (लो) 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, और 7.0 1 0.2 300 मांसपेशी प्रत्येक प्रोत्साहन के बीच 30 सेकंड के लिए आराम करने की अनुमति दें. मांसपेशी इष्टतम लंबाई का उपयोग कर एक डिजिटल कैलिपर उपाय. 3. टीए मांसपेशी की सीएसए = सीएसए (मांसपेशियों (छ) / [1.06 ग्राम / 3 सेमी (x लो x 0.6)] 0.6 TA मांसपेशी फाइबर लो ra लंबाई हैtio. तालिका 2 EDL और प्रादेशिक सेना की मांसपेशियों के यांत्रिक गुणों के मूल्यांकन के लिए पैरामीटर. तनाव आयु (माह) शरीर का वजन (छ) EDL वजन (एमजी) EDL लो (मिमी) EDL सीएसए (2 मिमी) BL10 6 32.03 ± 0.57 13.90 ± 0.77 14.09 ± 0.04 2.12 ± 0.12 MDX 6 35.44 ± * 0.42 16.73 ± * 0.42 13.93 ± * 0.05 2.57 ± * 0.07 तालिका 3. EDL की मांसपेशी के morphometric गुण *, एमडी में मूल्यx चूहों BL10 चूहों उम्र से मिलान से काफी अलग है. चित्रा 1. कस्टम निर्मित माउस विच्छेदन बोर्ड के एक योजनाबद्ध आरेख विच्छेदन बोर्ड एक आधा इंच मोटी plexiglass से बना है और संस्थागत दुकान पर निर्मित किया गया था. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . /> चित्रा 2. डिजिटल एक डबल वर्ग MTJ में एक पाश गाँठ द्वारा पीछा गाँठ बांधने के कदम दिखा छवियों की एक श्रृंखला Asterisk.EDL मांसपेशी, एरो, EDL की मांसपेशी के बाहर का पट्टा. /> चित्रा 3. Plexiglass पशु मंच स्वस्थानी टीए मांसपेशी समारोह परख के लिए कस्टम निर्मित मंच के एक योजनाबद्ध आरेख और स्टेनलेस स्टील घुटने धारक स्वस्थानी माउस तंत्र में 809B पर माउंट करने के लिए डिजाइन किए गए थे, स्टेनलेस स्टील रॉड (# MPR 2.0 बिल्ली. Siskiyou, अनुदान दर्रा, या),, यूनिवर्सल इलेक्ट्रोड धारक (# MXB बिल्ली, Siskiyou, अनुदान दर्रा, या), §, इलेक्ट्रोड लगाव रॉड (MPR-3.0 # बिल्ली, Siskiyou, अनुदान दर्रा, या); ** Sylgard ब्लॉक. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-paजीई = "हमेशा"> /> चित्रा 4. EDL की मांसपेशी के सिकुड़ा और निष्क्रिय संपत्तियों के लिए प्रतिनिधि परिणाम EDL की मांसपेशी के सिकुड़ा गुण. विशिष्ट चिकोटी बल (ए), विशिष्ट धनुस्तंभीय बल (बी), शिखर तनाव (सी) और आधा विश्राम का समय (डी) के लिए समय से होती है. EDL की मांसपेशी के निष्क्रिय गुण तनाव (ई) प्रोफाइल और SSR से मूल्यांकन कर रहे हैं. *, MDX चूहों काफी अलग से BL10 चूहों उम्र से मिलान कर रहे हैं.
Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम सिकुड़ा और निष्क्रिय गुण EDL मांसपेशियों और प्रादेशिक सेना की मांसपेशी के सिकुड़ा गुणों को मापने के लिए शारीरिक assays सचित्र है. मांसपेशी शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन में एक प्रमुख चिंता का विषय लक्ष्य की मांसपेशी के oxygenation है. बड़े मांसपेशियों के लिए (जैसे प्रादेशिक सेना मांसपेशियों के रूप में), स्वस्थानी दृष्टिकोण में क्योंकि घंटी बफर से ऑक्सीजन प्रसार इन विट्रो परख में पेशी के केंद्र नहीं एक में हो सकता है तक पहुँचने के लिए पसंद किया जाता है स्वस्थानी दृष्टिकोण में सामान्य रक्त की आपूर्ति और hypoxia-जुड़े परेशान नहीं करता है. कृत्रिम प्रभाव से परहेज कर रहे हैं. EDL मांसपेशी शरीर क्रिया विज्ञान के अध्ययन में सबसे अधिक इस्तेमाल की मांसपेशी के एक है. पूरे मांसपेशी की पर्याप्त oxygenation इन विट्रो प्रणाली में एक में किया जा सकता है की मांसपेशी के छोटे आकार की वजह से हासिल किया है. इसके अलावा, इन विट्रो प्रणाली में आयनों की सांद्रता (2 Ca +, ना + और कश्मीर +) में हेरफेर करने के लिए एक संलग्न पर्यावरण और chemi प्रदान करता हैकैलोरी (एटीपी और ग्लूकोज) है कि इष्टतम मांसपेशी बल पीढ़ी के लिए आवश्यक हैं. यह बल उत्पादन पर इन चर के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक महान अवसर प्रदान करता है.
अंग की मांसपेशी के सिकुड़ा और निष्क्रिय संपत्तियों की सटीक माप कंकाल की मांसपेशी समारोह का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. इन गुणों की विशेषता परिवर्तन अक्सर विभिन्न मांसपेशियों की बीमारियों की पहचान के रूप में माना जाता है. इन मानकों में परिवर्तन भी कर रहे हैं महत्वपूर्ण संकेतकों निर्धारित करने के लिए कि क्या एक प्रायोगिक चिकित्सा प्रभावी है या नहीं है.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम (AR 49,419, डीडी) स्वास्थ्य, पेशी Dystrophy एसोसिएशन (डीडी), और NIH प्रशिक्षण अनुदान T90DK70105 (CH) के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Material | Manufacturer | Specifications and comments | |
| Tissue-organ bath | Radnoti LLC, CA, USA | Water-jacket tissue bath (Cat #158351-LL), Oxygen disperser tube (Cat #160192), Luer valve (Cat#120722) | |
| Circulating water bath | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ||
| Gas mix | Airgas National, Charlotte, NC, USA | 95% O2 and 5% CO2 | |
| In vitro muscle function assay apparatus | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system consists of a stimulator (Model# 701A), a dual-mode lever system (Model#300C or 305C), a signal interface (Model # 604B) and a test apparatus (Model# 800A) to vertically mount tissue organ bath | |
| In vitro muscle function assay software | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | ||
| Mouse anesthesia cocktail mixed in 0.9% NaCl | Refer to the institutional guidelines | Ketamine (25 mg/ml), xylazine (2.5 mg/ml) and acepromazine (0.5 mg/ml). Throughout the surgical procedure, a supplement of 10 % of the initial dose may be needed to keep animal under anesthesia. | |
| Sylgard | World Precision Instrument | Cat#SYLG184 | |
| A custom-made Plexiglas dissection board | In house designed | Refer to Figure 1 | |
| Heating lamp | Tensor Lighting Company, Boston, MA, USA | 15 Watt lamp to keep the mouse warm during dissection | |
| Ringer’s Buffer | Chemicals are purchased from Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | Composition in mM: 1.2 NaH2PO4 (Cat#S369) , 1 MgSO4 (Cat# M63), 4.83 KCl (Cat# P217), 137 NaCl (Cat# 217), 24 NaHCO3 (Cat# S233), 2 CaCl2 (Cat #C79) and 10 glucose (Cat# D16). Dissolve chemicals individually and mix in the order listed above. Store at 4 °C. | |
| Stereo dissecting microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Dissection tools | Fine Science Tools, Foster City, CA, USA | Coarse forceps, coarse scissors, fine forceps (Straight and 45 ° angle) | |
| Braided silk suture #4-0 | SofSilk USSC Sutures, Norwalk, CT, USA | Cat # SP116 | |
| A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | 2” long S/S 304V (0.18” diameter) for force transducer 305C or 2.5” long S/S 304V (0.012” diameter) for transducer 300C (Cat# ASTM A313) | |
| In situ muscle function assay system | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | The system (809B, in situ mouse apparatus) consist of a stimulator (Model# 701B), a dual-mode lever system (Model# 305C), a signal interface (Model# 604A) and a thermo controlled footplate apparatus (Model# 809A) | |
| In vitro muscle function assay software | Aurora Scientific, Aurora, ON, Canada | Dynamic muscle control (DMC) software and dynamic muscle control data analysis (DMA) software | |
| A custom-made TA assay animal platform | In house designed | Refer to Figure 2 | |
| A custom-made stainless steel hook | Small Parts, Inc. | Cat# ASTM A313 | 0.5” long S/S 304V (0.18” diameter) |
| Custom-made 25G platinum electrodes | Chalgren Enterprises, Gilroy,CA | Solder two 0.016” thick platinum wires to two 24G electric wires |
Table 1. Materials and equipment.
Riferimenti
- Huijing, P. A. Muscle as a collagen fiber reinforced composite: a review of force transmission in muscle and whole limb. J. Biomech. 32, 329-345 (1999).
- Moss, R. L., Halpern, W. Elastic and viscous properties of resting frog skeletal muscle. Biophys. J. 17, 213-228 (1977).
- Hoffman, E. P., Brown, R. H., Kunkel, L. M. Dystrophin: the protein product of the Duchenne muscular dystrophy locus. Cell. 51, 919-928 (1987).
- Petrof, B. J., Shrager, J. B., Stedman, H. H., Kelly, A. M., Sweeney, H. L. Dystrophin protects the sarcolemma from stresses developed during muscle contraction. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 3710-3714 (1993).
- Pastoret, C., Sebille, A. mdx mice show progressive weakness and muscle deterioration with age. J. Neurol. Sci. 129, 97-105 (1995).
- Hakim, C. H., Grange, R. W., Duan, D. The passive mechanical properties of the extensor digitorum longus muscle are compromised in 2- to 20-mo-old mdx mice. J. Appl. Physiol. 110, 1656-1663 (2011).
- Segal, S. S., Faulkner, J. A. Temperature-dependent physiological stability of rat skeletal muscle in vitro. Am. J. Physiol. 248, 265-270 (1985).
- Grange, R. W., Gainer, T. G., Marschner, K. M., Talmadge, R. J., Stull, J. T. Fast-twitch skeletal muscles of dystrophic mouse pups are resistant to injury from acute mechanical stress. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 283, 1090-1101 (2002).
- Hakim, C. H., Duan, D. Gender differences in contractile and passive properties of mdx extensor digitorum longus muscle. Muscle Nerve. 45, 250-256 (2012).
- Hakim, C. H., Li, D., Duan, D. Monitoring murine skeletal muscle function for muscle gene therapy. Methods Mol. Biol. 709, 75-89 (2011).
Citazione di questo articolo
Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of Muscle Function of the Extensor Digitorum Longus Muscle Ex vivo and Tibialis Anterior Muscle In situ in Mice. J. Vis. Exp. (72), e50183, doi:10.3791/50183 (2013).