Extracelularmente Identificar las neuronas motoras de un músculo en la piscina Motor<em> Aplysia californica</em
Summary
En los animales con grandes neuronas identificadas (<em> Por ejemplo,</em> Moluscos), el análisis de los conjuntos motores se realiza utilizando técnicas intracelulares<sup> 1,2,3,4</sup>. Recientemente, hemos desarrollado una técnica para estimular extracelularmente y registrar las neuronas individuales en<em> Aplysia californica</em<sup> 5</sup>. Describimos ahora un protocolo para el uso de esta técnica para identificar de forma única y caracterizar las neuronas motoras dentro de un grupo motor.
Abstract
En los animales con grandes neuronas identificadas (por ejemplo, moluscos), el análisis de los conjuntos motores se realiza utilizando técnicas intracelulares 1,2,3,4. Recientemente, hemos desarrollado una técnica para estimular extracelularmente y registrar las neuronas individuales en Aplysia californica 5. Describimos ahora un protocolo para el uso de esta técnica para identificar de forma única y caracterizar las neuronas motoras dentro de un grupo motor.
Esta técnica tiene ventajas extracelular. Primeros electrodos extracelulares, puede estimular y registrar las neuronas a través de la vaina 5, por lo que no necesitan ser removidos. Así, las neuronas serán más saludables en los experimentos extracelulares que en los intracelulares. En segundo lugar, si los ganglios son girados por adecuada fijación de la vaina, electrodos extracelulares pueden acceder a las neuronas en ambos lados del ganglio, que hace que sea más fácil y eficiente para identificar múltiples neuronas en la misma preparación. En tercer lugar, extracelulareslar electrodos no necesitan penetrar en las células, y por lo tanto puede ser fácilmente movido hacia atrás y adelante entre las neuronas, se produce menos daño a ellos. Esto es especialmente útil cuando se intenta grabar múltiples neuronas durante repitiendo los patrones motores que sólo pueden persistir por minuto. Cuarto, los electrodos extracelulares son más flexibles que los intracelulares durante los movimientos musculares. Electrodos intracelulares pueden sacar y dañar las neuronas durante las contracciones musculares. En contraste, desde electrodos extracelulares se presiona suavemente sobre la vaina anterior neuronas, por lo general permanecer por encima de la misma neurona durante las contracciones musculares, y por lo tanto se pueden utilizar en preparaciones más intactas.
Para identificar las neuronas motoras para una piscina motor (en particular, el músculo I1/I3 en Aplysia) utilizando electrodos extracelulares, se pueden utilizar las funciones que no requieren mediciones intracelulares como criterios: tamaño soma y ubicación, proyección axonal, y la inervación del músculo 4, 6,7. Para el grupo de motor particular utilizado para ilustrar la técnica, se registraron a partir de nervios bucales 2 y 3 para medir las proyecciones axonales, y se midieron las fuerzas de contracción del músculo I1/I3 para determinar el patrón de inervación del músculo para las neuronas motoras individuales.
Se demuestra el proceso completo de la primera neuronas motoras que identifican utilizando la inervación del músculo, a continuación, la caracterización de su tiempo durante los patrones motores, la creación de un método simplificado de diagnóstico para la identificación rápida. El método de diagnóstico simplificada y más rápida es superior para las preparaciones más intactas, por ejemplo, en la preparación de la masa suspendida bucal 8 o 9 in vivo. Este proceso también se puede aplicar en otros conjuntos motores 10,11,12 en Aplysia o en otros sistemas de animales 2,3,13,14.
Protocol
Representative Results
Discussion
En los animales con grandes neuronas identificadas, tales como moluscos (por ejemplo, Lymnaea, Helix y Aplysia), el análisis de los conjuntos motores se realiza normalmente mediante registro intracelular 1,2,3,4. En este protocolo, se describe un procedimiento para la identificación exclusiva de las neuronas motoras para una piscina de motor usando una técnica extracelular. Se utilizaron las mediciones de la fuerza como una ilustración de este proceso. También se podría utilizar para m…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue financiada por el NIH subvención NS047073 y NSF subvención DMS1010434.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 10-500 Hz for the I2 nerve/muscle; 300-500 Hz for all the other nerves | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | Software for recordings | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 15 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
Riferimenti
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