Ekstraselüler bir kas Motor Pool için motor nöronlar belirlenmesi<em> Aplysia'nın californica</em
Summary
Büyük tespit nöronlar (ile hayvanlarda<em> Örneğin</em> Yumuşakçalar), motorlu havuzları analiz hücre içi teknikleri kullanılarak yapılır<sup> 1,2,3,4</sup>. Son zamanlarda, biz ekstraselüler bireysel nöronlar teşvik etmek ve kaydetmek için bir teknik geliştirdi<em> Aplysia'nın californica</em<sup> 5</sup>. Biz şimdi benzersiz bir şekilde tanımlamak ve motor havuzu içindeki motor nöronlar karakterize etmek için bu tekniği kullanmak için bir protokol açıklar.
Abstract
Büyük tespit nöronlar (örneğin yumuşakçalar), motor havuzları analizi ile hayvanlarda intraselüler teknikleri 1,2,3,4 kullanılarak yapılır. Son zamanlarda, biz ekstraselüler uyarmak ve Aplysia'nın californica 5 bireysel nöronların kaydetmek için bir teknik geliştirdi. Biz şimdi benzersiz bir şekilde tanımlamak ve motor havuzu içindeki motor nöronlar karakterize etmek için bu tekniği kullanmak için bir protokol açıklar.
Bu ekstraselüler teknik avantajları vardır. İlk olarak, hücre dışı elektrotlar uyarmak ve kaydetmek nöronlar kılıf ile 5 arasındaki, bu nedenle kaldırılması gerekli değildir olabilir. Böylece, nöronların hücre içi olanlardan daha hücre dışı deneylerde sağlıklı olacaktır. İkinci olarak, eğer ganglion kılıf bağlantılarını uygun göre döndürülür, hücre dışı elektrodlar daha kolay ve daha verimli aynı hazırlanmasında birden nöron tespit edilmesini sağlar gangliyon, her iki tarafına da nöronlar erişebilir. Üçüncü olarak, ekstraselülerlar elektrotlar hücreleri nüfuz gerek yok, ve böylece onları kolayca daha az zarar, nöronlar arasında ileri ve geri hareket ettirilebilir. Bir tek dakika sürebilir motor desenleri yinelenen sırasında birden nöronların kaydetmek için çalıştığında bu özellikle yararlıdır. Dördüncü olarak, ekstraselüler elektrotlar kas hareketleri sırasında intrasellüler olanlardan daha esnektir. Hücre içi elektrotlar çekin ve kas kasılmaları sırasında nöronlara zarar verebilir. Hücre dışı elektrotlar yavaşça nöronlar üzerinde kılıf üzerine basıldığında bu yana Buna zıt olarak, genellikle kas kasılmaları sırasında aynı nöron üzerinde kalmak ve böylece daha sağlam preparatlar da kullanılabilir.
Soma büyüklüğü ve yeri, aksonal yansıtma, ve kas innervasyon 4: benzersiz bir hücre dışı elektrotlar kullanılarak bir motor havuzu (özellikle, Aplysia olarak I1/I3 kas) için motor nöronlar belirlemek için, bir kriter olarak hücre içi ölçüm gerektirmezler özelliklerini kullanarak6,7. Tekniğin göstermek için kullanılan özel motor havuz için, aksonal projeksiyonlar ölçmek için bukkal sinirlerden 2 ve 3 kaydedilir ve tek tek motor nöronlar, kas innervasyonunun model belirlemek için I1/I3 kas kasılması güçler ölçülür.
Daha sonra hızlı bir tanımlama için basitleştirilmiş bir tanı yöntemi oluşturarak, motor desenleri sırasında zamanlama karakterize, kas innervasyonu kullanarak ilk tanımlayan motor nöronların tam işlem gösterilmektedir. Basitleştirilmiş ve daha hızlı tanı yöntemi askıya bukkal kütle hazırlama 8 veya in vivo 9 örneğin, daha sağlam hazırlıkları için üstündür. Bu işlem, aynı zamanda 2,3,13,14 Aplysia ya da diğer hayvan sistemleri içinde 10,11,12 diğer motorlu havuzlarda uygulanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu tür yumuşakçalar (örneğin, Lymnaea, Helix, ve Aplysia), motor havuzları analizi gibi büyük tespit nöronları ile hayvanlarda tipik olarak hücre içi kayıt 1,2,3,4 kullanılarak yapılır. Bu protokol, benzersiz bir hücre dışı tekniği kullanılarak bir motor havuzu için motor nöronlarının belirlenmesi için bir işlem açıklanmaktadır. Bu sürecin bir örneği olarak kuvvet ölçümleri kullanılmıştır. Bir de kas innervasyonu ölçmek için EMG kullanabilirsiniz. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma NIH hibe NS047073 ve NSF hibe DMS1010434 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S671 | Biological, Certified |
| Potassium chloride | Fisher Scientific | P217 | Certified ACS |
| Magnesium chloride hexahydrate | Acros Organics | 19753 | 99% |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63 | Certified ACS |
| Calcium chloride dihydrate | Fisher Scientifc | C79 | Certified ACS |
| Glucose (dextrose) | Sigma-Aldrich | G7528 | BioXtra |
| MOPS buffer | Acros Organics | 17263 | 99% |
| Carbachol | Acros Organics | 10824 | 99% |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | SS255 | Certified |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | SA49 | Certified |
| Single-barreled capillary glass | A-M Systems | 6150 | |
| Flaming-Brown micropipette puller model P-80/PC | Sutter Instruments | Filament used: FT345B | |
| Enamel coated stainless steel wire | California Fine Wire | 0.001D, coating h | |
| Household Silicone II Glue | GE | ||
| Duro Quick-Gel superglue | Henkel corp. | ||
| A-M Systems model 1700 amplifier | A-M Systems | Filter settings: 10-500 Hz for the I2 nerve/muscle; 300-500 Hz for all the other nerves | |
| Pulsemaster Multi-Channel Stimulator | World Precision Instruments | A300 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | A360 | |
| AxoGraph X | AxoGraph Scientific | Software for recordings | |
| Gold Connector Pins | Bulgin | SA3148/1 | |
| Gold Connector Sockets | Bulgin | SA3149/1 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Dow Corning | ||
| 100 x 15 mm Crystalizing Dish | Pyrex | ||
| High Vacuum Grease | Dow Corning | ||
| Pipet Tips | Fisher Scientific | 21-375D | |
| Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Modeling Clay | Sargent Art | 22-4400 | |
| Whisper Air Pump | Tetra | 77849 | |
| Aquarium Tubing | Eheim | 7783 | 12/16 mm |
| Elite Airstone | Hagen | A962 | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Dumont #5 Fine Forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34155 |
Riferimenti
- McCrohan, C. R., Benjamin, P. R. Synaptic relationships of the cerebral giant cells with motoneurones in the feeding system of Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 85, 169-186 (1980).
- Benjamin, P. R., Rose, R. M. Central generation of bursting in the feeding system of the snail, Lymnaea stagnalis. J. Exp. Biol. 80, 93-118 (1979).
- Peters, M., Altrup, U. Motor organization in pharynx of Helix pomatia. J. Neurophysiol. 52 (3), 389-409 (1984).
- Church, P. J., Cohen, K. P., Scott, M. L., Kirk, M. D. Peptidergic motoneurons in the buccal ganglia of Aplysia californica: immunocytochemical, morphological, and physiological characterizations. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 323-336 (1991).
- Lu, H., Chestek, C. A., Shaw, K. M., Chiel, H. J. Selective extracellular stimulation of individual neurons in ganglia. J. Neural. Eng. 5 (3), 287-309 (2008).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Expression of diverse neuropeptide cotransmitters by identified motor neurons in Aplysia. J. Neurosci. 11 (3), 618-625 (1991).
- Church, P. J., Lloyd, P. E. Activity of multiple identified motor neurons recorded intracellularly during evoked feedinglike motor programs in Aplysia. J. Neurophys. 72 (4), 1794-1809 (1994).
- McManus, J. M., Lu, H., Chiel, H. J. An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica. J. Vis. Exp. (70), e4320 (2012).
- Cullins, M. J., Chiel, H. J. Electrode fabrication and implantation in Aplysia californica for multi-channel neural and muscular recordings in intact, freely behaving animals. J Vis. Exp. (40), e1791 (2010).
- Zhurov, Y., Weiss, K. R., Brezina, V. Tight or loose coupling between components of the feeding neuromusculature of Aplysia. J. Neurophysiol. 94 (1), 531-549 (2005).
- Hurwitz, I., Goldstein, R. S., Susswein, A. J. Compartmentalization of pattern-initiation and motor functions in the B31 and B32 neurons of the buccal ganglia of Aplysia californica. J. Neurophysiol. 71 (4), 1514-1527 (1994).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. The timing of activity in motor neurons that produce radula movements distinguishes ingestion from rejection in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 173 (5), 519-536 (1993).
- Iles, J. F. Structure and synaptic activation of the fast coxal depressor motoneurone of the cockroach. Periplaneta americana. J. Exp. Biol. 56 (3), 647-656 (1972).
- Westerfield, M., McMurray, J. V., Eisen, J. S. Identified motoneurons and their innervation of axial muscles in the zebrafish. J. Neurosci. 6 (8), 2267-2277 (1986).
- Susswein, A. J., Rosen, S. C., Gapon, S., Kupfermann, I. Characterization of buccal motor programs elicited by a cholinergic agonist applied to the cerebral ganglion of Aplysia californica. J. Comp. Physiol. A. 179 (4), 509-524 (1996).
- Hurwitz, I., Neustadter, D., Morton, D. W., Chiel, H. J., Susswein, A. J. Activity patterns of the B31/B32 pattern initiators innervating the I2 muscle of the buccal mass during normal feeding movements in Aplysia californica. J. Neurophys. 75 (4), 1309-1326 (1996).
- Morton, D. W., Chiel, H. J. In vivo buccal nerve activity that distinguishes ingestion from rejection can be used to predict behavioral transitions in Aplysia. J. Comp. Physiol. A. 172 (1), 17-32 (1993).
- Warman, E. N., Chiel, H. J. A new technique for chronic single-unit extracellular recording in freely behaving animals using pipette electrodes. J. Neurosci. Methods. 57 (2), 161-169 (1995).
- Nargeot, R. N., Baxter, D. A., Byrne, J. H. Contingent-dependent enhancement of rhythmic motor patterns: an in vitro analog of operant conditioning. J. Neurosci. 17 (21), 8093-8105 (1997).
- Kandel, E. R. . Behavioral biology of Aplysia. , (1979).
- Scott, M. L., Govind, C. K., Kirk, M. D. Neuromuscular organization of the buccal system in Aplysia californica. J. Comp. Neurol. 312 (2), 207-222 (1991).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Outputs of radula mechanoafferent neurons in Aplysia are modulated by motor neurons, interneurons, and sensory neurons. J. Neurophysiol. 83 (3), 1621-1636 (2000).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83 (3), 1605-1620 (2000).
- Weiss, K. R., Chiel, H. J., Koch, U., Kupfermann, I. Activity of an identified histaminergic neuron, and its possible role in arousal of feeding behavior in semi-intact Aplysia. J. Neurosci. 6 (8), 2403-2415 (1986).
- Rosen, S. C., Teyke, T., Miller, M. W., Weiss, K. R., Kupfermann, I. Identification and characterization of cerebral-to-buccal interneurons implicated in the control of motor programs associated with feeding in Aplysia. J. Neurosci. 11 (11), 3630-3655 (1991).
- Jing, J., Weiss, K. R. Generation of variants of a motor act in a modular and hierarchical motor network. Curr. Biol. 15 (19), 1712-1721 (2005).
- Azizi, F., Lu, H., Chiel, H. J., Mastrangelo, C. H. Chemical neurostimulation using pulse code modulation (PCM) microfluidic chips. J. Neurosci. Methods. 192 (2), 193-198 (2010).
- Zhurov, Y., Proekt, A., Weiss, K. R., Brezina, V. Changes of internal state are expressed in coherent shifts of neuromuscular activity in Aplysia feeding behavior. J. Neurosci. 25 (5), 1268-1280 (2005).
- Baker, B. J., Kosmidis, E. K., Vucinic, D., Falk, C. X., Cohen, L. B., Djurisic, M., Zecevic, D. Imaging brain activity with voltage- and calcium-sensitive dyes. Cell. Mol. Neurobiol. 25 (2), 245-282 (2005).
- Fejtl, M., Stett, A., Nisch, W., Boven, K. -. H., Möller, A., Baudry, M., Taketani, M. On Micro-Electrode Array Revival. Advances in Network Electrophysiology Using Multi-Electrode Arrays. , 24-37 (2006).
