Isolation und Differenzierung von Stroma-Vascular Cells Beige / Brite Cells
Summary
Primäre weißen Präadipozyten aus weißem Fettgewebe von Mäusen isoliert werden in beige / brite Zellen unterschieden werden. Präsentiert hier ist ein zuverlässiger zellulären Modellsystem, um die molekulare Regulation von "Bräunung" der weiße Fett zu studieren.
Abstract
Braunen Fettzellen haben die Fähigkeit, die Atmungskette der Mitochondrien entkoppeln und dissipieren chemische Energie als Wärme. Entwicklung UCP1-positiven braunen Fettzellen in weißem Fettgewebe (sogenannte beige oder brite Zellen) hoch ist durch eine Vielzahl von Umweltreize wie chronische Kälteexposition oder durch PPAR &ggr; Agonisten induziert wird, somit hat dieses Zelltyps Potential als therapeutisches Ziel für Behandlung von Fettleibigkeit. Obwohl die meisten verewigt Adipozyten Linien nicht rekapitulieren können den Prozess der "Bräunung" der weißen Fett in Kultur, primären Adipozyten aus stromalen vaskulären Fraktion im subkutanen weißen Fettgewebe (WAT) isoliert eine zuverlässige zelluläre System, um die molekulare Kontrolle der beige / brite-Zell-Entwicklung zu studieren . Hier beschreiben wir ein Protokoll für eine effektive Trennung von Primär-und Präadipozyten zur Induzierung der Differenzierung zu beige / brite Zellen in Kultur. Die Bräunung Effekt kann durch die Expression von braunem Fett-selektive Markierung beurteilt werdenten wie UCP1.
Introduction
Adipositas ist dramatisch zunehmenden weltweit und ist heute eines der schwerwiegendsten Bedenken für die öffentliche Gesundheit 1 betrachtet. Dieser Zustand ist mit einem Ungleichgewicht in der Energieaufnahme relativ zu Ausgaben und führt überschüssige Energie als Lipid in weißem Fettgewebe (WAT) gespeichert verwandt. Vergrößerten WAT ist mit einer erhöhten Körpermasse und Gewicht zugeordnet ist, während braunes Fettgewebe hat die Fähigkeit, überschüssige Energie abzuleiten, um Wärme zu erzeugen. Daher BAT kann als Schutz gegen Kälte und Übergewicht 2,3 funktionieren. Dies wird durch Auskuppeln der Elektronentransport in Mitochondrien durch entkoppelnde Protein 1 (UCP1) erreicht. Dieses Protein wird als ein Markenzeichen für nonshivering Thermogenese in BAT 3. Mehrere Studien in den letzten Jahren gezeigt, dass erwachsene Menschen funktionale BAT 4-8 haben und somit Manipulation von BAT beim Menschen kann eine mögliche therapeutische Intervention im Kampf gegen Fettleibigkeit und die damit verbundenen Krankheiten.
jove_content "> Aktuelle Daten zeigen, dass zwei Arten von braunen Fettzellen bei Nagetieren existieren;" klassischen "oder" pre-existierenden "braunes Fett entwickelt sich während der pränatalen Phase und bildet gewidmet braunen Fettgewebe Depots in interskapularen Region und anderen peripheren Geweben Auf der anderen Seite. ein "induzierbare" Form von braunem Fett (sogenannte brite oder beige Zellen) entwickelt sich während der postnatalen Stufe und erscheint durchsetzt im weißen Fettgewebe. Die zwei Typen von braunen Fettzellen auch von verschiedenen Entwicklungsstadien Ursprünge getrennt. Während die vorbestehenden braunen Fettzellen entstehen aus myoblastsic-ähnliche Myf5 Vorstufen entstehen die induzierbare brite / beige Zellen in WAT durchsetzt von einem nicht-Abstammungslinie Myf5 9,10. Zusätzlich Regulationswege dieses Zelltyps wahrscheinlich unterschiedlich vom Myf5 abgeleiteten braun ist Adipozyten 11. Die Entwicklung der beige Zellen (dh "Bräunungs" von weißem Fett) in Reaktion auf chronische Kälteexposition und aktiviert werdenβ3-Adrenozeptor-Agonisten oder PPAR &ggr;-Agonisten bei Erwachsenen 12-14. Die beige / brite Zellen wahrscheinlich ein vielversprechendes therapeutisches Ziel für Manipulation Gesamtenergiebilanz sein und kann potentiell Teil Entfettungskur geworden, daher ist es wichtig, genaue molekulare Mechanismen und Signalwege durch welche Umweltreize steuern die Entwicklung der beige verstehen Zellen.Um die molekulare Kontrolle der Bräunung von weißem Fett zu verstehen, werden in vitro-Versuche am besten als Differenzierung von Präadipozyten erfolgt vielmehr asynchron geeignet und es ist schwierig, die Zellen in situ 15 detektieren. Obwohl Studien zur Entwicklung Adipozyten somit haben bis jetzt überwiegend auf Zelllinien wie 3T3-L1, 3T3-F442A oder HIB1 durchgeführt erscheinen diese Zelllinien, die molekulare Unterschrift beige Zellen fehlt. Auf der anderen Seite, sind primäre Adipozyten aus subkutaner WAT isoliert am ehesten die Verarbeitung rekapitulierens der Bräunung der weiße Fett in einer Zelle autonom. Hier bieten wir ein Protokoll für eine effektive Isolierung des Stroma-Kreislauf-Fraktion aus Fettgewebe und zur Induktion der Bräunung von weißem Fett in Reaktion auf PPAR &ggr;-Agonisten. Rosiglitazon ist gezeigt worden, eine besonders effektive Mediator Bräunungsgrad in diesen Zellen vorhanden sein. Wie zuvor 16 angedeutet, kann dieses zellulare System verwendet, um eine zuverlässige Zellularsystem um die Entwicklung von beige / brite Zellen zu untersuchen dienen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier präsentieren wir Ihnen eine zuverlässige zelluläre System, um die Entwicklung von beige / brite Zellen in primären kultivierten Adipozyten in Mäusen untersucht werden. Wie zu mehreren verfügbaren immortalisierten Zelllinien verglichen werden, ist dieses System dürfte verbesserte Relevanz für die Bräunung der weißen Fett in vivo bieten.
Obwohl die Studie dieser primären Adipozyten bietet einige Vorteile, es existieren auch einige Einschränkungen und Bedenken, die unb…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Haruya Ohno, Kosaku Shinoda, Louis Sharp, Emi Tomoda und Lauren Ruiz für Diskussionen, technische Hilfe und redaktionelle Unterstützung auf dem Manuskript. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem NIH (DK087853), aus dem Programm für Breakthrough Biomedical Research und von Asubio Pharm Inc. SKULA wurde von einem Anteil PhD-Stipendien an der Universität von Kopenhagen und dem EU FP7 Projekt Diabat (HEALTH-F2 abgestützt -2.011-278.373) an Lise Madsen und Karsten Kristiansen. Wir erkennen auch die DERC Zentrum Zuschuss (NIH P30 DK063720).
Materials
| Reagent | |||
| Collaginase D | Roche | 11088874103 | |
| Dispase II | Roche | 04942078001 | |
| CaCl2 | |||
| DMEM medium | Fisher | 10017-CV | With 2,5 g/l glucose & L-glutamine without sodium pyruvate |
| Insulin | |||
| T3 (3,3′,5-Triiodo-L-thyronine) | Sigma | T-2877 | |
| Indomethacin | Sigma | I-7378 | |
| Dexamethasone | Sigma | D-1756 | |
| IBMX | Sigma | I-5879 | |
| Rosiglitazone | Sigma | R-2408 | |
| Equipment | |||
| Collagen coated dishes | BD | 354450 | 10 cm plates |
| 70 μm filter | BD Falcon | 352350 | Cell strainer,70 μm nylon 1/ea |
Riferimenti
- Barness, L. A., Opitz, J. M., Gilbert-Barness, E. Obesity: genetic, molecular, and environmental aspects. American Journal of Medical Genetics. Part A. 143A, 3016-3034 (2007).
- Rothwell, N. J., Stock, M. J. Combined effects of cafeteria and tube-feeding on energy balance in the rat. The Proceedings of the Nutrition Society. 38, 5A (1979).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: function and physiological significance. Physiological Reviews. 84, 277-359 (2004).
- Cypess, A. M., et al. Identification and importance of brown adipose tissue in adult humans. The New England Journal of Medicine. 360, 1509-1517 (2009).
- van Marken Lichtenbelt, W. D., et al. Cold-activated brown adipose tissue in healthy men. The New England Journal of Medicine. 360, 1500-1508 (2009).
- Virtanen, K. A., et al. Functional brown adipose tissue in healthy adults. The New England Journal of Medicine. 360, 1518-1525 (2009).
- Zingaretti, M. C., et al. The presence of UCP1 demonstrates that metabolically active adipose tissue in the neck of adult humans truly represents brown adipose tissue. FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 23, 3113-3120 (2009).
- Saito, M., et al. High incidence of metabolically active brown adipose tissue in healthy adult humans: effects of cold exposure and adiposity. Diabetes. 58, 1526-1531 (2009).
- Seale, P., et al. PRDM16 controls a brown fat/skeletal muscle switch. Nature. 454, 961-967 (2008).
- Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2010).
- Coulter, A. A., Bearden, C. M., Liu, X., Koza, R. A., Kozak, L. P. Dietary fat interacts with QTLs controlling induction of Pgc-1 alpha and Ucp1 during conversion of white to brown fat. Physiological Genomics. 14, 139-147 (2003).
- Klingenspor, M. Cold-induced recruitment of brown adipose tissue thermogenesis. Experimental Physiology. 88, 141-148 (2003).
- Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. 73, 9-15 (1016).
- Ghorbani, M., Himms-Hagen, J. Appearance of brown adipocytes in white adipose tissue during CL 316,243-induced reversal of obesity and diabetes in Zucker fa/fa rats. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders: Journal of the International Association for the Study of Obesity. 21, 465-475 (1997).
- Hansen, J. B., Kristiansen, K. Regulatory circuits controlling white versus brown adipocyte differentiation. The Biochemical Journal. 398, 153-168 (2006).
- Ohno, H., Shinoda, K., Spiegelman, B. M., Kajimura, S. PPARy agonists induce a white-to-brown fat conversion through stabilization of PRDM16 protein. Cell metabolism. 15, 395-404 (2012).
- Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding. Cell Metabolism. 15, 480-491 (2012).
- Cinti, S. Transdifferentiation properties of adipocytes in the adipose organ. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 297, E977-E986 (2009).
- Barbatelli, G., et al. The emergence of cold-induced brown adipocytes in mouse white fat depots is determined predominantly by white to brown adipocyte transdifferentiation. American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 298, E1244-E1253 (2010).
- Petrovic, N., et al. Chronic peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) activation of epididymally derived white adipocyte cultures reveals a population of thermogenically competent, UCP1-containing adipocytes molecularly distinct from classic brown adipocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 7153-7164 (2009).
- Rong, J. X., et al. Adipose mitochondrial biogenesis is suppressed in db/db and high-fat diet-fed mice and improved by rosiglitazone. Diabetes. 56, 1751-1760 (2007).
- Wilson-Fritch, L., et al. Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. The Journal of Clinical Investigation. 114, 1281-1289 (2004).
- Sell, H., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonism increases the capacity for sympathetically mediated thermogenesis in lean and ob/ob mice. Endocrinology. 145, 3925-3934 (2004).
- Fukui, Y., Masui, S., Osada, S., Umesono, K., Motojima, K. A new thiazolidinedione, NC-2100, which is a weak PPAR-gamma activator, exhibits potent antidiabetic effects and induces uncoupling protein 1 in white adipose tissue of KKAy obese mice. Diabetes. 49, 759-767 (2000).
- Vernochet, C., et al. C/EBPalpha and the corepressors CtBP1 and CtBP2 regulate repression of select visceral white adipose genes during induction of the brown phenotype in white adipocytes by peroxisome proliferator-activated receptor gamma agonists. Molecular and Cellular Biology. 29, 4714-4728 (2009).
- Tai, T. A., et al. Activation of the nuclear receptor peroxisome proliferator-activated receptor gamma promotes brown adipocyte differentiation. The Journal of Biological Chemistry. 271, 29909-29914 (1996).
- Sugii, S., et al. PPARgamma activation in adipocytes is sufficient for systemic insulin sensitization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 22504-22509 (2009).
