Utilisation quantitative PCR en temps réel pour déterminer prise de greffe de donneurs de cellules dans un modèle murin concurrentiel greffe de moelle osseuse
Summary
Détermination de la prise de greffe de cellule donneuse présente un défi dans des modèles de souris moelle osseuse greffe qui n'ont pas bien définis marqueurs phénotypiques. Nous avons décrit une méthodologie pour quantifier les hommes greffe de cellule donneuse dans des souris femelles bénéficiaires de greffes. Cette méthode peut être utilisée dans toutes les souches de souris pour l'étude des fonctions HSC.
Abstract
Modèles murins de greffe de moelle osseuse constituent un outil important pour mesurer de cellules souches hématopoïétiques (CSH) et les gènes qui déterminent les fonctions / molécules qui régulent la CSH. Dans ces systèmes, le modèle de transplantation, la fonction des cellules souches hématopoïétiques est déterminé par la capacité de ces cellules à des souris greffer et reconstituer bénéficiaires irradiées de façon létale. Communément, la cellule donneuse contribution / prise de greffe est mesurée par des anticorps spécifiques aux bailleurs de protéines de surface cellulaire par cytométrie en flux. Cependant, cette méthode dépend fortement de la spécificité et de la capacité du marqueur de surface cellulaire pour différencier des bailleurs de fonds des cellules dérivées de cellules destinataire-nées, qui peuvent ne pas être disponibles pour toutes les souches de souris. Compte tenu de la diversité des souches de souris génétiquement modifiées sur le marché, cette surface cellulaire / cytométrie de flux basé sur la méthode comporte des limites importantes en particulier dans les souches de souris qui n'ont pas bien définis marqueurs de surface de cellules du donneur séparer congéniques destinataire CElls. Ici, nous avons enregistré une technique basée sur la PCR pour déterminer la prise de greffe de cellule donneuse / contribution à des souris receveuses de transplantation. Nous avons transplanté hommes CSH donneurs de moelle osseuse de souris irradiées de façon létale congéniques femmes. Échantillons de sang périphérique ont été prélevés au moment de post-transplantation différents points. Des échantillons de moelle osseuse ont été obtenus à la fin des expériences. L'ADN génomique a été isolé et le gène du chromosome Y spécifique, Zfy1, a été amplifié par PCR en temps réel quantitative. La prise de greffe des hommes donneurs de cellules dérivées des souris receveuses femelles a été calculé par rapport à la courbe standard avec pourcentage connu des ADN masculins vs femme. Bcl2 a été utilisé comme gène de référence pour normaliser la quantité d'ADN total. Nos données suggèrent que cette approche permet de déterminer de manière fiable la prise de greffe de cellule donneuse et fournit une méthode utile, mais simple dans la mesure de la reconstitution hématopoïétique dans des modèles murins de transplantation de moelle osseuse. Notre méthode peut être effectué systématiquement dans la plupart des laboratoires, car aucunéquipements coûteux comme la cytométrie de flux est nécessaire.
Introduction
Murin moelle osseuse (MO) transplantation modèle a été développé dans les années 1960 1. Ce modèle a été largement utilisé pour l'étude des cellules souches donateurs hématopoïétiques (CSH) la biologie dans une souris hôte receveur. Murin modèle de greffe de moelle osseuse nous a fourni de précieuses connaissances sur les fonctions HSC et de leur régulation et est indispensable dans la recherche HSC. Allogénique modèle greffe de moelle osseuse comme C57BL/6J H2b-souris Balb / C H2d ou d'un modèle de transplantation congéniques CD45.2 comme C56Bl/6J-B6.SJL CD45.1 sont utilisés dans de nombreux laboratoires pour étudier la fonction des gènes sur l'activité HSC 2, effet de traitement de la toxicomanie sur les maladies de fonction 3 ou greffe de CSH connexes tels que la réaction du greffon contre l'hôte (GvHD) 4.
Marqueurs de surface cellulaire tels que haplotype CMH ou CD45.1 sont couramment utilisés pour distinguer les donneurs de cellules dérivées de cellules de destinataire origine. C57BL/6J H2b, CD45.2 </sup>, Balb / C H2d et B6.SJL CD45.1 sont les souches de souris les plus couramment utilisés dans la greffe de moelle osseuse, car la contribution cellule donneuse peut être facilement évaluée par cytométrie en flux mesure CD45.1 vs vs CD45.2 ou H2b H2D. Cependant, de nombreuses autres souches telles que FVB / NJ 5 et C3H sont également souvent utilisé pour générer transgénique ou génétiquement des souris knockout. Ces souris peuvent être recroisé à une lignée consanguine et maintenus dans un mélange génétique / CMH arrière-plan. Dans ces cas, la détermination de la prise de greffe de cellule donneuse et la fonction HSC pourrait être difficile en tant que marqueurs de surface spécifiques des donneurs de cellules peuvent ne pas être disponibles.
Utilisation du chromosome Y spécifique sonde d'ADN pour détecter les cellules du donneur mâle par transfert de Southern de sexe dépareillés greffe de moelle osseuse a été développé par le groupe du Dr Miwa 6. Ensuite, une PCR en temps réel pour la région Y détermination du sexe a été jugée une méthode précise et hautement spécifique pour quantifier macellules fœtales LE dans le système sanguin maternel 7. Ce concept a été adapté par le groupe du Dr Schwarzenberger pour le développement d'une technique de PCR en temps réel dans un modèle de transplantation de moelle osseuse murine pour déterminer la prise de greffe de cellule donneuse 8. Nous avons également modifié cette méthode pour la mesure de la prise de greffe de cellule donneuse dans FVB / NJ modèle osseuse de souris greffe de moelle. Cette méthode est actuellement largement utilisés dans notre groupe pour étudier le rôle de la kinase PIM1 en biologie HSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'objectif de notre étude est de fournir aux spectateurs une technique basée sur la PCR pour quantifier la prise de greffe de cellule donneuse dans un modèle concurrentiel osseuse murine greffe de moelle. Plusieurs études ont été rapportés par RT-PCR pour détecter les cellules du donneur dans des modèles de transplantation 9-10. Le groupe du Dr Schwarzenberger a d'abord développé un modèle murin de greffe de moelle osseuse en utilisant PCR en temps réel pour amplifier chromosome Y spécif…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Dr Charles Greenberg pour l'utilisation de sa machine PCR en temps réel. Ce travail est soutenu par MUSC Hollings Cancer Center fonds de démarrage, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Foundation Award développement de carrière, le NIH 1K08HL 103780-01A1, et les NIH 3P30CA138313-01S3. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de la National Institutes of Health ou des agents de financement.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
Riferimenti
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