Utilizzando quantitativa real-time PCR per la determinazione cellulare attecchimento dei donatori in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo
Summary
Determinare l'attecchimento delle cellule del donatore rappresenta una sfida in modelli di trapianto di midollo osseo di topo che non hanno ben definiti marcatori fenotipici. Abbiamo descritto una metodologia per quantificare maschio attecchimento delle cellule del donatore nel topo femmina riceventi di trapianto. Questo metodo può essere utilizzato in tutti i ceppi di topo per lo studio delle funzioni HSC.
Abstract
Murini osseo modelli di trapianto di midollo fornire un importante strumento per la misurazione di cellule staminali ematopoietiche (HSC) funzioni e geni che determinano / molecole che regolano la CSE. In questi sistemi modello di trapianto, la funzione di CSE è determinato dalla capacità di queste cellule di topi riceventi attecchire e ricostituire letalmente irradiati. Comunemente, la cellula donatrice contributo / attecchimento si misura con gli anticorpi alle proteine delle cellule del donatore-specifici di superficie in citometria a flusso. Tuttavia, questo metodo dipende fortemente la specificità e la capacità del marcatore di superficie cellulare per differenziare donatore cellule derivate da cellule destinatario-origine, che possono non essere disponibili per tutti i ceppi di topo. Considerando i vari ambiti di provenienza di ceppi di topi geneticamente modificati sul mercato, questa superficie delle cellule / citometria a flusso a base di metodo presenta limitazioni significative soprattutto in ceppi di topi che mancano ben definiti marcatori di superficie di cellule del donatore separate da congenic destinatario ceLLS. Qui, abbiamo riportato un PCR-based tecnica per determinare l'attecchimento delle cellule del donatore / contributo in topi riceventi di trapianto. Abbiamo trapiantato maschi donatori cellule staminali emopoietiche del midollo osseo di topi irradiati letalmente congenici femminili. Campioni di sangue periferico sono stati raccolti in diversi tempi post-trapianto punti. Campioni di midollo osseo sono stati ottenuti al termine degli esperimenti. DNA genomico è stato isolato e il gene cromosoma Y specifico Zfy1, è stato amplificato mediante PCR quantitativa in tempo reale. L'attecchimento dei maschi donatori cellule derivate nei topi riceventi femminili è stato calcolato contro curva standard con percentuale nota di DNA maschile vs femminile. Bcl2 è stato usato come un gene di riferimento per normalizzare la quantità totale di DNA. I nostri dati suggeriscono che questo approccio determina affidabile attecchimento delle cellule del donatore e fornisce un metodo utile, ma semplice per misurare la ricostituzione delle cellule ematopoietiche in modelli murini di trapianto di midollo osseo. Il nostro metodo può essere eseguita di routine nella maggior parte dei laboratori perché noapparecchiature costose quali citometria di flusso è necessario.
Introduction
Murine midollo osseo (BM) trapianto di modello è stato sviluppato nel 1960 1. Questo modello è stato ampiamente utilizzato per lo studio di cellule staminali ematopoietiche del donatore (HSC) biologia in un mouse destinatario host. Murine midollo osseo trapianto di modello ci ha fornito preziose conoscenze sulle funzioni HSC e la loro regolazione ed è indispensabile nella ricerca HSC. Trapianto allogenico di midollo osseo trapianto di modello come C57BL/6J H2b-Balb / C H2D o modello trapianto congenic come C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 sono utilizzati in molti laboratori per studiare la funzione dei geni sull'attività HSC 2, effetto di trattamento farmacologico di patologie HSC funzione 3 o il trapianto correlati, come graft-versus-host disease (GvHD) 4.
Marcatori cellulari di superficie come aplotipo MHC o CD45.1 sono comunemente usati per distinguere i donatori cellule derivate da cellule destinatario-origine. C57BL/6J H2b, CD45.2 </sup>, Balb / C e H2D B6.SJL CD45.1 sono i ceppi di topi più comunemente utilizzate nel trapianto di midollo osseo in quanto il contributo cellula donatrice può essere facilmente valutata mediante citometria a flusso misurando CD45.1 vs CD45.2 o H2b vs H2D. Tuttavia, molti altri ceppi come FVB / NJ 5 e C3H sono spesso utilizzati per generare transgenici o geneticamente topi knockout. Questi topi possono essere re-incrociata a una linea inbred e mantenuto in un ambiente misto genetico / MHC sfondo. In questi casi, la determinazione delle cellule attecchimento donatore e funzione HSC potrebbe essere difficile da donatori specifici marcatori di superficie delle cellule può non essere disponibile.
Utilizzando Y-cromosoma-specifici test sul DNA per individuare le cellule del donatore di sesso maschile con macchia meridionale sesso non corrispondenti trapianto di midollo osseo è stato sviluppato dal gruppo del Dr. Miwa 6. Poi, una real-time PCR per l'determina il sesso Y regione è risultato essere un metodo accurato ed altamente specifico per quantificare maLe cellule fetali nel sangue materno sistema 7. Questo concetto è stato adattato da Dr. Schwarzenberger gruppo per lo sviluppo di una real-time PCR in un modello murino di trapianto di midollo osseo per determinare cellula donatrice attecchimento 8. Abbiamo ulteriormente modificato questo metodo per la misura di attecchimento delle cellule del donatore in FVB / NJ modello trapianto di midollo osseo del mouse. Questo metodo è attualmente ampiamente utilizzata nel nostro gruppo per studiare il ruolo della chinasi PIM1 in biologia HSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'obiettivo del nostro studio è quello di fornire il pubblico una tecnica PCR per quantificare l'attecchimento delle cellule del donatore in un modello murino competitivo trapianto di midollo osseo. Diversi studi sono stati riportati con RT-PCR per rilevare le cellule del donatore in modelli di trapianto 9-10. Gruppo del Dr. Schwarzenberger primo sviluppato un modello murino di midollo osseo trapianto con real-time PCR per amplificare y-cromosoma-specifici 8. Questo metodo è stato utilizz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Dott. Carlo Greenberg per l'uso della sua macchina in tempo reale PCR. Questo lavoro è supportato da MUSC Hollings Cancer Center di avvio del fondo, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancer Premio alla Carriera della Fondazione per lo sviluppo, NIH 1K08HL 103780-01A1, e NIH 3P30CA138313-01S3. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non necessariamente rappresentano le opinioni ufficiali del National Institutes of Health o agenti di finanziamento.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
Riferimenti
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