Använda kvantitativ realtids-PCR för att avgöra Engraftment donatorcellen i en konkurrenskraftig Murine Bone Marrow Transplantation Modell
Summary
Fastställande engraftment givarcell utgör ett problem i benmärg hos möss transplantation modeller som saknar väldefinierade fenotypiska markörer. Vi beskrev en metod för att kvantifiera manlig engraftment donatorcellen hos honmöss transplantation mottagare. Denna metod kan användas i alla musstammar för att studera HSC funktioner.
Abstract
Murina benmärgstransplantation modellerna ger ett viktigt verktyg för att mäta hematopoetiska stamceller (HSC) funktioner och bestämma gener / molekyler som reglerar HSCs. I dessa system transplanterade modell, är funktionen av HSC: er bestämdes genom förmågan hos dessa celler att ympa och rekonstituera letalt bestrålade mottagande möss. Vanligen är donatorcellen bidrag / ympning mäts genom antikroppar mot donator-specifika cellyteproteiner med flödescytometri. Detta beror dock metoden mycket på specificitet och förmåga cellytan markör för att skilja donator-härledda celler från mottagare-ursprung celler, som inte finns för alla musstammar. Med tanke på de olika bakgrunder av genetiskt modifierade musstammar på marknaden, har denna cellytan / flödescytometri-baserad metod betydande begränsningar, särskilt i musstammar som saknar väldefinierade ytmarkörer att separera donator celler från kongena mottagare ceLLS. Här rapporterade vi en PCR-baserad teknik för att bestämma ympning donatorcellen / bidrag i möss transplantatmottagare. Vi transplanterade manliga givare HSCs benmärgen att letalt bestrålade kongena honmöss. Perifera blodprover uppsamlades vid olika tidpunkter efter transplantation. Benmärgsprov erhölls vid slutet av experimenten. Genomiskt DNA isolerades och Y-kromosomen specifika genen, Zfy1, amplifierades med användning av kvantitativ realtids-PCR. Den inympning av manliga givare härledda celler i de kvinnliga mottagande mössen beräknades mot standardkurva med känd procentandel manliga kontra kvinnliga DNA. BCL2 användes som en referens gen att normalisera det totala DNA-mängden. Våra data tyder på att detta tillvägagångssätt tillförlitligt bestämmer engraftment givarcell och ger en användbar, men ändå enkel metod att mäta hematopoetiska celler rekonstitution i murina benmärgstransplantation modeller. Vår metod kan rutinmässigt i de flesta laboratorier eftersom ingakostsam utrustning såsom flödescytometri krävs.
Introduction
Murin benmärg (BM) transplantation modell utvecklades först på 1960-talet 1. Denna modell har använts i stor utsträckning för att studera donator hematopoetiska stamceller (HSC) biologi i en värd mottagare mus. Murin benmärgstransplantation modell har gett oss värdefull kunskap om HSC funktioner och deras reglering och är nödvändig i HSC forskning. Allogen benmärgstransplantation modell som C57BL/6J H2b-Balb / C-H2D eller kongena transplantation modell som C56Bl/6J CD45.2-B6.SJL CD45.1 används i många laboratorier för att studera geners funktion på HSC aktivitet 2, effekt missbruksbehandling på HSC funktion 3 eller transplantation sjukdomar som graft-versus-host sjukdom (GvHD) 4.
Cellytmarkörer såsom MHC-haplotyp eller CD45.1 vanligen används för att särskilja donator-härledda celler från mottagare-ursprung celler. C57BL/6J H2b, CD45.2 </sup>, Balb / C-H2D och B6.SJL CD45.1 är de vanligaste musstammar vid benmärgstransplantation eftersom donatorcellen bidraget kan lätt bedömas genom flödescytometri mäter CD45.1 vs CD45.2 eller H2b vs H2D. Men många andra stammar som FVB / NJ 5 och C3H också ofta används för att generera genetiskt transgena eller möss knockout. Dessa möss kan tillbakakorsade till en inavlad linje och hålls i en blandad genetisk / MHC bakgrund. I dessa fall kan bestämma engraftment givarcell och HSC funktion vara svårt som givare specifik cellytmarkörer kanske inte är tillgängliga.
Med Y-kromosom-specifik DNA-prob för att detektera donator manliga cellerna genom Southern blot i sex-felmatchade benmärgstransplantation har utvecklats av Dr Miwa grupp 6. Därefter tillsattes en realtids-PCR för kön-bestämmande region Y befunnits vara en noggrann och mycket specifik metod för att kvantifiera male fetala celler i moderns blodsystemet 7. Detta koncept anpassades av Dr Schwarzenberger grupp för utveckling av en realtids-PCR-teknik i en murin benmärgstransplantation modell för att bestämma engraftment donatorcellen 8. Vi ändrade vidare denna metod för mätning av donatorcellen engraftment i FVB / NJ mus benmärgstransplantation modell. Denna metod är för närvarande omfattande används i vår grupp för att studera vilken roll Pim1 kinas i HSC biologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med vår nuvarande studie är att ge publiken en PCR-baserad teknik för att kvantifiera engraftment donatorcellen i en konkurrenskraftig murin benmärgstransplantation modell. Flera studier har rapporterats med RT-PCR för att detektera donatorceller vid transplantation modeller 9-10. Dr Schwarzenberger grupp utvecklade först en murin ben modell benmärgstransplantation med realtids-PCR för att förstärka y-kromosom-specifika 8. Denna metod användes för att studera Gli-1 funktion i HSC…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr Charles Greenberg för användning av sin realtids-PCR maskin. Detta arbete stöds av Musc Hollings Cancer Center Startup Fund, Hollings Cancer Center ACS IRG, ASCO Conquer Cancerfonden Award Karriärutveckling, NIH 1K08HL 103.780-01A1, och NIH 3P30CA138313-01S3. Innehållet är endast ansvar författarna och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health eller andra medel finansiering.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30255.01 | |
| FBS | Invitrogen | 16140-017 | Heat inactivated |
| Ammonium chloride | MP Biomedicaals | 194806 | |
| Potassium Bicarbonate | Fisher | P184-500 | |
| QIAamp DNA Blood minikit | Qiagen | 51106 | |
| Cell strainer | BD bioscience | ||
| iQ SYBR Green supermix | Biorad | 170-8882 | |
| iQ5 real time PCR machine | Biorad | ||
| Spectra photometer | Nanodrop ND-1000 | ND-1000 |
Riferimenti
- McCulloch, E. A., Till, J. E. The radiation sensitivity of normal mouse bone marrow cells, determined by quantitative marrow transplantation into irradiated mice. Radiat. Res. 13, 115-125 (1960).
- Xiao, N., et al. Hematopoietic stem cells lacking Ott1 display aspects associated with aging and are unable to maintain quiescence during proliferative stress. Blood. 119, 4898-4907 (2012).
- Kang, Y., Chen, B. J., Deoliveira, D., Mito, J., Chao, N. J. Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model. PLoS One. 5, e11316 (2010).
- Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
- Taketo, M., et al. FVB/N: an inbred mouse strain preferable for transgenic analyses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 2065-2069 (1991).
- Morisaki, H., et al. Genotypic analysis using a Y-chromosome-specific probe following bone marrow transplantation. Am. J. Hematol. 27, 30-33 (1988).
- Lo, Y. M., et al. Quantitative analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum: implications for noninvasive prenatal diagnosis. Am. J. Hum. Genet. 62, 768-775 (1998).
- Byrne, P., et al. Chimerism analysis in sex-mismatched murine transplantation using quantitative real-time PCR. Biotechniques. 32, 279-280 (2002).
- Ma, X., et al. Contribution of recipient-derived cells in allograft neointima formation and the response to stent implantation. PLoS One. 3, e1894 (2008).
- Bosio, E., et al. A comparison between real-time quantitative PCR and DNA hybridization for quantitation of male DNA following myoblast transplantation. Cell Transplant. 13, 817-821 (2004).
- Merchant, A., Joseph, G., Wang, Q., Brennan, S., Matsui, W. Gli1 regulates the proliferation and differentiation of HSCs and myeloid progenitors. Blood. 115, 2391-2396 (2010).
- Nagamine, C. M., Chan, K., Hake, L. E., Lau, Y. F. The two candidate testis-determining Y genes (Zfy-1 and Zfy-2) are differentially expressed in fetal and adult mouse tissues. Genes & development. 4, 63-74 (1990).
- Grundler, R., et al. Dissection of PIM serine/threonine kinases in FLT3-ITD-induced leukemogenesis reveals PIM1 as regulator of CXCL12-CXCR4-mediated homing and migration. J. Exp. Med. 206, 1957-1970 (2009).
