Mitochondrien-assoziierte ER Membranen (MAMs) und Glycosphingolipid Angereichert Mikrodomänen (GEM): Isolation aus Mäusehirn
Summary
Dieser Vorgang zeigt, wie aus dem erwachsenen Gehirn der Maus die Mitochondrien-assoziierte ER Membranen oder MAMs und den Glykosphingolipid angereicherten Mikrodomänen Fraktionen aus MAMs und mitochondrialen Vorbereitungen zu isolieren.
Abstract
Intrazellulären Organellen sind hochdynamische Strukturen mit unterschiedlicher Form und Zusammensetzung, die Zell-spezifischen intrinsischen und extrinsischen Hinweise ausgesetzt sind. Ihre Membranen werden häufig an definierten Kontaktstellen, die Naben für den Austausch von Signalmolekülen und Membrankomponenten 1,2,3,4 geworden gegenübergestellt. Die miteinander organellären Membranmikrodomänen, die zwischen dem endoplasmatischen Retikulum (ER) und den Mitochondrien bei der Öffnung des IP3-Ca 2 +-Kanal als den Mitochondrien-ER zugehörigen Membranen oder MAMs 4,5,6 bekannt sind ausgebildet sind. Das Protein / Lipid-Zusammensetzung und biochemischen Eigenschaften dieser Membran Kontaktstellen wurden ausgiebig insbesondere in Bezug auf ihre Rolle bei der Regulierung der intrazellulären Ca 2 + 4,5,6 untersucht. Die ER dient als primären Speicher von intrazellulärem Ca 2 +, und reguliert in diesem Rahmen eine Vielzahl von zellulären Prozessen stromabwärts von Ca 2 +-Signalisierung, inkl.uding posttranslationale Proteinfaltung und Protein maturation7. Mitochondrien, auf der anderen Seite aufrechtzuerhalten Ca 2 +-Homöostase durch Puffern zytosolischen Ca 2 +-Konzentration wodurch die Einleitung Apoptosewege stromabwärts von Ca 2 + 4,8 Unwucht. Der dynamische Charakter der MAMs macht sie zu idealen Standorte, um grundlegende zelluläre Mechanismen, einschließlich Ca 2 +-Signalisierung und Regulation der mitochondrialen Ca 2 +-Konzentration, Lipid-Biosynthese und Transport, Energiestoffwechsel und das Überleben der Zelle 4,9,10,11,12 sezieren. Mehrere Protokolle wurden für die Reinigung dieser Mikrodomänen aus Lebergewebe und kultivierten Zellen 13,14 beschrieben.
Unter zuvor publizierten Methoden in Betracht, haben wir ein Protokoll für die Isolierung von Mitochondrien und MAMs vom erwachsenen Mäusehirn angepasst. Um dieses Verfahren haben wir eine zusätzliche Reinigungsstufe, nämlich ein Triton X100 Extraktion hinzugefügt, die enables die Isolierung des Glycosphingolipid angereicherten Mikrodomäne (GEM) Bruchteil der MAMs. Diese Zubereitungen GEM teilen sich mehrere Proteinkomponenten mit Caveolae und Lipidflößen, aus der Plasmamembran oder anderen intrazellulären Membranen abgeleitet und vorgeschlagen, als Sammelpunkte für die Bündelung von Rezeptorproteinen und für Protein-Protein-Wechselwirkungen 4,15 funktionieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Stellen des Kontakts zwischen intrazellulären Membranen oder zwischen Organellen und der Plasmamembran von Zellen repräsentieren dynamischen Signalisierung Plattformen für grundlegende zelluläre Prozesse. Die genaue Charakterisierung ihrer Funktion und Zusammensetzung sowohl unter physiologischen und pathologischen Bedingungen erfordert zuverlässige und reproduzierbare Reinigung Protokolle. Die Verfahren detailliert hier wurden speziell von unserem Labor zur Isolierung und Aufreinigung der MAMs und ihre entspre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir erkennen den Beitrag von Renata Sano in der Konzeption des ersten Protokolls. Ad'A. hält die Jewelers Für Kinder (JFC) Stiftungsprofessur für Genetik und Gentherapie. Diese Arbeit wurde zum Teil durch NIH Zuschüsse GM60905, DK52025 und CA021764, und den amerikanischen libanesischen syrischen Assoziierte Charities (ALSAC) finanziert.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Fractionation | |||
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Calcium Chloride, Dihydrate | Sigma-Aldrich | C-5080 | |
| MAM | |||
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M9546-250G | |
| Hepes | Fisher Scientific | BP310-500 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E4378-250G | |
| BSA, Fraction V, Heat Shock, Lyophilizate | Roche | 03-116-964-001 | |
| Percoll | GE | 17-0891-02 | |
| GEM | |||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 ml | |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Tris Base | Roche | 03-118-142-001 | |
| HCl | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| EDTA | Fisher Scientific | BP120-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Fisher Scientific | BP166-500 | |
| Common | |||
| Protease Inhibitors Tablets, Complete EDTA-free | Roche | 11-873-580-001 | |
| EQUIPMENT | |||
| 2 ml Douce All-Glass Tissue Grinders | Kimble Chase | 885300-0002 | |
| 15 ml Polypropylene Conical Centrifuge Tubes, BD Falcon | BD | 352097 | |
| 30 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-30 | |
| 15 ml Round-Bottom Glass Centrifuge Tubes | Kimble Chase | 45500-15 | |
| Ultracentrifuge tubes, Ultra-Clear, Thinwall, 14×89 mm | Beckman-Coulter | 344059 | |
| Parafilm | Cole-Parmer | PM996 | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets, 9″ | Fisher Scientific | 13-678-20C |
Riferimenti
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