快速比色测定RNA和DNA生物分子样品进行定性区分

Summary

甲套件迅速判别蛋白质，RNA，DNA，并重新引入糖在潜在的异质性的生物分子样品的比色测定法进行说明。

Abstract

生化实验通常需要准确的知识，在早期阶段，所述的核酸，蛋白质，和其他生物分子的组成部分，在潜在的异构试样。核酸可以被检测到，通过几个既定的方法，包括分析方法，有分光光度法（ 例如 ，A _260），荧光（ 例如 ，荧光染料的结合），或比色（核苷，具体的显色化学反应的^）。1虽然它可以不容易区分RNA从DNA，A ₂₆₀ / A ₂₈₀比值是常用的，因为它提供了一个简单，快速的^评估 ，核酸的相对含量，主要吸收近260 nm和蛋白质，主要吸收280纳米附近的。视为指示“纯粹的”蛋白标本比率<0.8，而纯化的核酸，其特征在于，（NA）的比率> 1.5 ^3。

何wever，有场景，其中的蛋白质/ NA含量不能明确或可靠的推断，从简单的紫外 – 可见分光光度法测量。例如，（ⅰ）样品可能包含一个或多个蛋白质，这是相对缺乏负责吸收≈280nm处（色氨酸，酪氨酸，苯丙氨酸）的芳族氨基酸，是与一些小的RNA结合蛋白的情况下，并（二）样品可以表现出中间A ₂₆₀ / A ₂₈₀比值（0.8〜1.5），其中的蛋白质/ NA含量远远不太清楚，甚至可能反映了一些高亲和力的蛋白和NA之间的关联。在这样的情况下，我们描述了一套比色法快速区分RNA，DNA和还原糖的一个潜在的混合样品的生物分子。该方法依赖本笃十六世戊糖和其他碳水化合物不同的敏感度，BIAL（地衣酚），Dische（二苯胺）试剂;流线型的协议可以是COM处理完成，在短短的几分钟内，没有任何额外的步骤隔离组件。该试验可以被并行地执行，来区分的RNA和DNA，以及指示免费的还原糖，如葡萄糖，果糖，核糖（ 图1）的存在下。

Introduction

许多细胞生物学发生通过涉及DNA和RNA的分子间的相互作用^。4这些天然存在的核酸（NAS）彼此互动^，5与蛋白质，第⁶和在体内与主机的小分子化合物和配位体（ 例如 ，二价阳离子^7）。的相互作用可能是短期或长期的（动力学），范围从高至中度到低亲和力的（热力学实力），而且也表现在化学性质上的巨大变化和特异性-某些团体是很特别的（ 例如 ，DNA· ··转录因子，RNA···剪接因子），而其他的相互作用是必然远比更通用的（ 例如 ，DNA···细菌组蛋白样胡蛋白质^8）。可以有非特异性相互作用与定居在体外实验中，涉及的混合物biomo实际后果lecules，因为它是可能的，甚至是有可能的，一些定居将与感兴趣的生物分子的关联，至少在所使用的实验条件下的一些子集（离子强度，溶液pH值， 等 ）。

考虑，例如， 通过异源表达的重组蛋白在大肠杆菌中的细胞培养生产的一种蛋白质（POI）的感兴趣的，在几乎任何结构生物学实验室，这样的程序进行例行⁹在进一步的实验中准备的，例如生物化学/生物物理特性，结晶， 等 ，最初的努力一般都集中于获得足够数量的POI作为尽可能纯的一种形式，理想状态为化学均质和生物物理单分散的试样。破坏的宿主细胞后，一个典型的纯化工作流程的早期阶段的目标是隔离的POI从大肠杆菌大肠杆菌的蛋白质，核酸，细胞壁碎片，和其他部件的细胞溶胞产物。但是，主机NAS合作净化的POI数理化的原因-一个非常基本的POI非特异性下拉宿主DNA / RNA的POI可能有一个通用的NA-约束力的活动（ 例如 ，上述HU）;该POI可能是一个相当具体的NA-结合蛋白，但表现出与宿主的RNA或DNA的交叉反应性，主机定居可能交互用色谱基质，从而简单地与POI共洗脱;及等等。不分青红皂白，高亲和性结合的主机来港定居的POI，可以构成一个棘手的问题，，因为NA杂质可能会影响下游实验（ 如荧光的各向异性实验的POI•RNA结合^10）。或者，未预料到的POI的···NA协会也可以被看作偶然的，作为这种相互作用照亮​​的POI的核酸结合能力。无论哪种方式，是否定居是关键部件或污染物，一个必须首先量化和识别类型（DNA，RNA）的共同净化定居下游实验准备。

存在几种分析方法，用于检测和定量样品中定居。大多数可用的方法是从根本上无论是分光光度法（ 例如 ，A吸光度值₂₆₀和A ₂₆₀ / A _280的比率），荧光（ 例如 ，有约束力的噻唑橙或其他荧光染料NA），或色度（核苷化学反应的敏感性收率的发色团吸收的电磁波谱的UV-Vis区域），最近由De梅伊等人描述^。1然而，识别类型的多核苷酸的RNA或DNA的关键步骤是超出了范围，许多这些定量的方法。在这里，我们提供了一套比色测定法，以迅速确定的蛋白质样品中的NA组件的类型。

该协议描述这里c可以有效地执行而无需额外的步骤中分离的潜在NA杂质，和依靠Benedict的测定用于减少糖^11，地衣酚测定戊糖^12,13，和二苯基胺的反应^14,15的2'-deoxypentoses（ 图1和图2） 。的笃的测试（ 图2a）利用的能力的线性，开放-链（醛）形式的醛糖糖以减少铜^{2 +，}伴随氧化的糖的羰基，以一个羧酸酯基团和生产的Cu _{2 O的}作为不溶性沉淀。该反应将测试带免费还原糖，如醛糖和酮糖（转换到相应的醛糖通过 enediol中间体）阳性，但不与被锁定的共价骨干的DNA或RNA的多核苷酸的一部分成环状形式的戊糖。由于简约的半缩醛功能的要求，其他共同mpounds试验阳性在这个测定法- ，因此作为潜在的干扰物-包括α-羟基酮和短低聚糖（ 例如 ，二糖麦芽糖）。无论是BIAL地衣酚（ 图2b），是在初始破坏的多核苷酸骨干Dische的二苯胺（ 图2c）的反应， 通过脱嘌呤核苷和进一步的酸，或碱催化的水解的父核苷酸，使其呋喃-2甲醛（ 糠醛 ）衍生物，这些衍生物然后与多羟基酚，如地衣酚（BIAL）或二苯胺试剂形成彩色的缩合产物，很大程度上是未知的化学结构（Dische）。的DNA与RNA特异性Dische的检测源于一个事实，即与戊糖必须是2'-脱氧以易被氧化的ω-hydroxylevulinyl醛，其中，还与二苯胺反应在酸性条件下产生一个明亮的蓝色凝析（ 图2c）。使用这里描述的精简协议，我们已经发现这些糖特定的比色反应可以区分的RNA和DNA，并也将表明的免费的还原糖，如葡萄糖，果糖，或核糖的生物分子样品中的存在。

Protocol

1。本笃十六世为还原糖的含量本笃十六世的试剂准备一个合适的数量 – 940毫米无水碳酸钠，588 mM柠檬酸钠脱水，68毫米铜（II）五水硫酸铜。这种试剂可以存储在室温（RT）为至少6个月，没有明显的反应性变化。 上述试剂是6倍。因此，600μL的反应中，加入100μl本笃十六世试剂一干净的1.5ml离心管（ 如 Eppendorf公司品牌），每个样品进行检测。 加入任何地方从10微升至50…

Representative Results

结果示于图3，用于应用这些已知的参考化合物的比色测 ​​定法。代表性的定性数据笃的：（a），BIAL的地衣酚（b）中和Dische的二苯胺（三）测定所示，这三个检测的标准曲线示于图4中 。在面板3（交流），左侧面板显示阳性/阴性对照实验中，使用适当的无功/不反应的分析物，这些可视化的结果示于原位 ，在所描述的比色皿，在协议中，1-3（以上）。右子板各?…

Discussion

比色法这里提供一个简单的方法来快速评估，如时遇到的纯化蛋白质，RNA或全细胞裂解物的复合物，准备进一步研究生物分子混合物的化学性质。结构生物学追求更自然的组件，逐步更大的挑战，如样本的异质性，将所构成的复杂和多组分复合物。超分子组装往往只有轻微稳定，他们的成功分离纯化条件可能要求不那么严格（ 例如 ，如发现剪接snRNP复合^17,18）。在这样的温和?…

Materials

Reagent or equipment	Supplier/company	Catalog number	Comments, notes
Anhydrous sodium carbonate	Fisher Scientific	S263
Sodium citrate dihydrate	Sigma	S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate	VWR	VW3312-2
Orcinol monohydrate	Sigma-Aldrich	O1875
Concentrated HCl	VWR	BDH3030
Ferric chloride hexahydrate	Sigma	F-2877
Diphenylamine	Aldrich	112763
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A28
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Ethanol	Koptec	V1101
Ribose	Sigma	R-7500	prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker’s yeast (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus	Sigma	D1501	prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C
			Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.