Hurtige kolorimetriske analyser til kvalitativ Skelne RNA og DNA i Biomolekylær Samples

Summary

En suite af kolorimetriske assays er beskrevet for hurtigt skelne protein, RNA, DNA, og re-duktion sukker i potentielt heterogene biomolekylære prøver.

Abstract

Biochemical eksperimenter kræver sædvanligvis præcis viden, på et tidligt stadium, af nukleinsyre, protein og andre biomolekylære komponenter i potentielt heterogene prøver. Nukleinsyrer kan detekteres via adskillige etablerede metoder, herunder analytiske metoder, som er spektrofotometrisk (f.eks A _260), fluorometriske (fx binding af fluorescerende farvestoffer) eller kolorimetriske (nukleosid-specifikke chromogene kemiske reaktioner). ^En Selv om det ikke kan let at skelne RNA fra DNA, A ₂₆₀ / _A280-forhold er almindeligt anvendt, da det giver en enkel og hurtig ^a vurdering af den relative indhold af nukleinsyre, der absorberer overvejende i nærheden af 260 nm og protein, der absorberer hovedsagelig nær 280 nm. Forhold <0,8 tages som indikation af "rene" protein prøver, medens ren nukleinsyre (NA) er kendetegnet ved forhold> 1,5 ^3.

However, der situationer, hvor protein / NA indhold kan ikke så klart eller pålideligt udledes simple UV-vis spektrofotometriske målinger. For eksempel prøver (i) kan indeholde et eller flere proteiner, som er relativt fri for de aromatiske aminosyrer er ansvarlige for absorption ved ≈ 280 nm (Trp, Tyr, Phe), som det er tilfældet med nogle små RNA-bindende proteiner, og (ii) prøver kan udvise mellemliggende A ₂₆₀ / _A280-forhold (~ 0,8 <~ 1.5), hvor protein / NA indhold er langt mindre klar og kan endog afspejle en høj affinitet associering mellem proteinet og NA komponenter. Til sådanne scenarier, beskriver vi heri en suite af kolorimetriske analyser til hurtigt at skelne RNA, DNA og reducerende sukkerarter i en potentielt blandede prøve af biomolekyler. Metoderne er afhængige af forskellig sensitivitet af pentoser og andre kulhydrater til Benedikts, Bial s (orcinol), og Dische s (diphenylamin) reagenser, de strømlinede protokoller kan være comafsluttet i løbet af få minutter, uden nogen yderligere trin der til isolering af bestanddelene. Assayene kan udføres parallelt for at skelne mellem RNA og DNA, samt angive tilstedeværelsen af frie reducerende sukkerarter, såsom glucose, fructose og ribose (Figur 1).

Introduction

Meget af cellebiologi sker via molekylære interaktioner, der involverer DNA og RNA. ^Fire Disse naturligt forekommende nukleinsyrer (NK) interagerer med hinanden, ⁵ med proteiner, ⁶ og med en række små molekyler og ligander in vivo (f.eks divalente kationer ^7). Samspillet kan være kort eller lang levetid (kinetisk), kan variere fra høj til moderat til lav affinitet (termodynamisk styrke), og kan også udvise betydelig variation i kemiske egenskaber og specificitet – nogle foreninger er meget specifikke (f.eks DNA · · · transkriptionsfaktorer, RNA · · · splejsningsfaktorer), mens andre interaktioner er nødvendigvis langt mere generisk (f.eks DNA · · · bakterielle histon-lignende HU-proteiner ^8). Ikke-specifikke interaktioner med NAS kan få praktiske konsekvenser for di vitro forsøg med blandinger af biomolecules, da det er muligt, og endda sandsynligt, at nogle kontorer vil associere med de biomolekyler af interesse, i det mindste under en vis delmængde af de eksperimentelle betingelser, som anvendes (ionstyrke, pH, osv.).

Overvej for eksempel produktion af et protein af interesse (POI) via heterolog overekspression af det rekombinante protein i Escherichia coli-cellekultur; sådan procedure udføres rutinemæssigt i stort set alle strukturel biologi lab ⁹ I forberedelse til yderligere eksperimenter, f.eks. som biokemisk / biofysisk karakterisering, krystallisering osv., indledende bestræbelser normalt fokusere på at opnå en tilstrækkelig mængde af POI i så ren en form som muligt, helst som en kemisk homogen og biofysisk monodispers prøve. Efter afbrydelse af værtsceller, sigter de tidlige stadier af en typisk oprensning workflow at isolere POI fra E. coli-proteiner, nukleinsyrer, cell wall debris,og andre komponenter i det cellulære lysat. Imidlertid kan host kontorer co-oprenses med POI flere fysisk-kemiske grunde – et stærkt basisk POI kan ikke-specifikt pull-down host DNA / RNA, POI kan have en generisk NA-bindende aktivitet (f.eks ovennævnte HU); POI kan være temmelig specifikke NA-bindende protein, men udviser krydsreaktivitet med værts-RNA'er eller DNA'er, host NA'er kan reagere med en kromatografi-matrix og derved simpelthen co-elueres med POI, og så videre. Vilkårlig, højaffinitetsbinding af vært NA til et IP kan udgøre et irriterende problem, fordi NA urenheder sandsynligvis vil forstyrre efterfølgende eksperimenter (for eksempel fluorescens-anisotropi assays af POI • RNA-binding ^10). Alternativt uventet POI · · · NA foreninger også kan ses tilfældigt, da sådanne interaktioner belyse POI nukleinsyre-bindende kapacitet. Uanset hvad, uanset om kontorer er centrale elementer eller forurenende stoffer, må man først kvantificere ogidentificere typen (DNA, RNA) af co-oprensning NA'er som forberedelse til efterfølgende eksperimenter.

Adskillige analytiske metoder eksisterer til detektion og kvantificering NA i en prøve. De fleste af de tilgængelige fremgangsmåder er grundlæggende enten spektrofotometrisk (fx en ₂₆₀ absorbansværdier og A ₂₆₀ / A _{280-forhold),} fluorometriske (fx binding af thiazol orange eller andre fluorescerende farvestoffer til NA) eller kolorimetriske (følsomhed af nucleosider til kemiske reaktioner at udbyttet kromoforer absorberer i UV-VIS område af det elektromagnetiske spektrum), som for nylig beskrevet af De Mey et al. ^1. Men det afgørende trin for at identificere, hvilken type polynukleotid som RNA eller DNA er uden for mange af disse kvantificering fremgangsmåder. Her giver vi et sæt kolorimetriske assays til hurtigt at identificere de typer af NA-komponenter i en proteinholdig prøve.

Protokollerne beskrevet her cen være effektivt udføres uden yderligere trin med isolering af de potentielle NA urenheder, og stole på Benedikts assay til reducerende sukker ^11, den orcinol assay for pentoser ^12,13, og diphenylamin reaktioner ^14,15 af 2'-deoxypentoses (figur 1 og 2) . The Benedict test (figur 2a) udnytter evnen af den lineære, åbenkædede (aldehyd) form af en aldose sukker for at reducere Cu ^{2 +,} med ledsagende oxidation af sukkeret er carbonyl en carboxylat-del og produktion af _Cu2 O som en uopløseligt rødt bundfald. Denne reaktion vil teste positive med frie reducerende sukkerarter, såsom aldoser og ketoser (som omdanner til de tilsvarende aldoser via enediol mellemprodukter), men ikke med pentosesukkerstoffer der er låst til cyklisk form som en del af den kovalente rygraden i et DNA-eller RNA-polynukleotid. På grund af den minimalistiske krav om en fri hemiacetal funktionalitet, andre compounds der kunne testes positive i dette assay – og derfor fungere som potentielle interfererende – omfatter α-hydroxy-ketoner og korte oligosaccharider (f.eks disaccharidet maltose). Både Bial s orcinol (figur 2b), Dische s diphenylamin (fig. 2c) reaktioner er baseret på indledende ødelæggelse af polynukleotidet backbone, via depurinering af nucleosidet og yderligere syre-eller basekatalyseret hydrolyse af forældrene nukleotider, til opnåelse af furan-2 -carbaldehyd (furfural) derivater, disse derivater derefter omsættes med enten en polyhydroxy-phenol, såsom orcinol (Bial s) eller diphenylamin (Dische s) reagenser til dannelse af farvede kondensationsprodukter af stort set ukendt kemisk struktur. DNA'et versus RNA specificitet Dische s assayet skyldes, at den pentose sukker skal 2'-deoxygeneret for at være modtagelige for oxidation til ω-hydroxylevulinyl aldehyd, som yderligere reagerer med diphenylaminunder sure betingelser til opnåelse af en lys blå kondensat (figur 2c). Anvendelse af de strømlinede protokollerne der er beskrevet her, har vi fundet, at disse sukker-specifikke kolorimetriske reaktioner kan skelne mellem RNA og DNA og kan også indikere tilstedeværelsen af ​​frie reducerende sukkerarter, såsom glucose, fructose, ribose eller i en biomolekylær prøve.

Protocol

1. Benedikts Assay for reducerende sukkerarter Der fremstilles en passende mængde Benedicts prøve – 940 mM vandfrit natriumcarbonat, 588 mM natriumcitrat dehydrat, 68 mM kobber (II) sulfate pentahydrate. Dette reagens kan opbevares ved stuetemperatur (RT) i mindst seks måneder uden synlig ændring i reaktivitet. Ovennævnte reagens er 6x. Således for 600 pi reaktioner, tilsættes 100 pi Benedicts prøve til et rent 1,5 ml mikrocentrifugerør (fx Eppendorf mærke), per prøve, der skal a…

Representative Results

Resultaterne er vist i figur 3 for anvendelse af disse kolorimetriske assays til kendte referenceforbindelser. Repræsentative kvalitative data er vist for Benedikts (a), BIAL s orcinol (b), og Dische s diphenylamin (c) assays, og standardkurver for disse tre assays er vist i figur 4.. I paneler 3 (ac), viser de venstre paneler positive / negative kontrolforsøg med passende reaktive / ikke-reaktive analytter, disse visuelle resultater er vist in situ, i kuvetterne, der er besk…

Discussion

De kolorimetriske assays præsenteret her tilbyde en simpel metode til hurtigt at vurdere den kemiske natur af biomolekylære blandinger, såsom støder ved rensning af proteiner, RNA'er eller komplekser fra helcelle-lysat som forberedelse til yderligere undersøgelser. Som strukturel biologi forfølger flere native-lignende forsamlinger, gradvist større udfordringer, såsom prøve heterogenitet, vil blive stillet af de indviklede og multi-komponent-komplekser. Supramolekylære samlinger er ofte kun marginalt…

Materials

Reagent or equipment	Supplier/company	Catalog number	Comments, notes
Anhydrous sodium carbonate	Fisher Scientific	S263
Sodium citrate dihydrate	Sigma	S-4641
Copper (II) sulfate pentahydrate	VWR	VW3312-2
Orcinol monohydrate	Sigma-Aldrich	O1875
Concentrated HCl	VWR	BDH3030
Ferric chloride hexahydrate	Sigma	F-2877
Diphenylamine	Aldrich	112763
Glacial acetic acid	Fisher Scientific	A28
Sulfuric acid	Sigma-Aldrich	258105
Ethanol	Koptec	V1101
Ribose	Sigma	R-7500	prep at 1% w/v in H2O
Ribonucleic acid from baker’s yeast (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	prep at 10 mg/ml in H2O; store at -20 °C
Deoxyribonucleic acid (sodium salt), from calf thymus	Sigma	D1501	prep at 10 mg/ml in H2O; store at 4 °C
			Reagents, Equipment & Safety Materials are listed in the following table in the order in which they appear in the Protocol section. Unless otherwise noted (above), all reagents can be stored at ambient room temperature and lighting. For any items not listed below (e.g., microcentrifuge tubes), the usual make / model / variety found in a standard biochemical laboratory can be used (e.g., Eppendorf brand 1.5 ml microfuge tubes). Standard plastic microfuge tubes should be used for steps involving centrifugation (e.g., to sediment particulate material near the end of each protocol). No particular material is preferable, as long as the tubes can be sealed; the typical polypropylene tubes found in biochemistry laboratories work well. In terms of safety concerns and waste disposal, standard laboratory precautions (safety glasses, fume hoods) should be exercised in pre-paring, working with, and disposing of solutions containing concentrated acetic, hydrochloric, or sulfuric acids. For organic reagents such as orcinol or diphenylamine, nitrile gloves are preferable to the common latex (natural rubber) variety.