Rapid test colorimetrici per distinguere qualitativamente RNA e del DNA nei campioni Biomolecolari

Sommario

Una suite di test colorimetrici è descritto per le proteine ​​rapidamente distinguere, RNA, DNA, e la possibilità di ridurre gli zuccheri in campioni biomolecolari potenzialmente eterogenei.

Abstract

Sperimentazione biochimica generalmente richiede una conoscenza accurata, in una fase iniziale, l'acido nucleico, proteine ​​e altri componenti biomolecolari in campioni potenzialmente eterogenei. Gli acidi nucleici possono essere rilevati tramite diversi approcci stabiliti, compresi metodi analitici spettrofotometrico (ad esempio, A _260), fluorometrico (ad esempio, il legame di coloranti fluorescenti), o colorimetrica (nucleoside-specifiche reazioni chimiche cromogeni). ¹ Anche se non può facilmente distinguere RNA da DNA, la A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rapporto è comunemente impiegato, in quanto offre un semplice e rapido ² valutazione del contenuto relativo di acido nucleico, che assorbe prevalentemente vicino 260 nm e proteine, che assorbe principalmente vicino 280 nm. Rapporti <0,8 sono presi come indicativo di "puri" i campioni di proteine, mentre il puro acido nucleico (NA) è caratterizzata da rapporti di> 1,5 ^3.

HoWever, ci sono scenari in cui la proteina / NA contenuto non può essere nel modo più chiaro e affidabile dedurre da semplici misure spettrofotometriche UV-VIS. Per esempio, (i) i campioni possono contenere una o più proteine ​​che sono relativamente privo degli amminoacidi aromatici responsabili di assorbimento a 280 nm (≈ Trp, Tyr, Phe), come è il caso con alcuni piccoli RNA-binding proteins, e (ii) i campioni possono presentare intermedi A ₂₆₀ / A ₂₈₀ rapporti (~ 0.8 <~ 1.5), dove la proteina / NA contenuto è molto meno chiara e può anche riflettere un po 'alta affinità associazione tra la proteina e componenti NA. Per tali scenari, si descrive qui una suite di test colorimetrici per distinguere rapidamente RNA, DNA, e zuccheri riduttori in un campione potenzialmente misto di biomolecole. I metodi si basano sulla sensibilità differenziale di pentosi e altri carboidrati a Benedetto, Bial di (orcinol), e di Dische (difenilammina) reagenti; protocolli ottimizzati possono essere comcompletato in pochi minuti, senza ulteriori passaggi di dover isolare i componenti. I saggi possono essere eseguiti in parallelo per distinguere tra RNA e DNA, così come indica la presenza di zuccheri riducenti liberi quali glucosio, fruttosio, ribosio e (Figura 1).

Introduzione

Molto di biologia cellulare avviene attraverso interazioni molecolari che coinvolgono DNA e RNA. ⁴ Questi acidi nucleici naturali (AN) interagiscono tra loro, ^{5, 6} con proteine ​​e con una serie di piccole molecole composti e ligandi in vivo (ad esempio, cationi bivalenti ^7). Le interazioni possono essere di breve o di lunga durata (cineticamente), può variare da elevata a moderata a bassa affinità (forza termodinamico), e può anche esporre sostanziale variazione delle proprietà chimiche e specificità - alcune associazioni sono molto specifici (ad esempio, il DNA · · · i fattori di trascrizione, RNA · · · fa....

Protocollo

1. Saggio di Benedetto per la riduzione degli Zuccheri

1. Preparare una quantità adeguata di reattivo di Benedict - 940 carbonato di sodio anidro mM, 588 mM di citrato di sodio diidrato, 68 mM di rame (II) pentaidrato solfato. Questo reagente può essere conservato a temperatura ambiente (RT) per almeno sei mesi senza alcun cambiamento visibile della reattività.
2. Il reagente sopra è 6x. Così, per 600 reazioni ul, aggiungere 100 ml di reattivo di Benedict per un ambiente pulito 1,5 ml microcentrifuga tubo (ad esempio, Eppendorf marca), per campione da dosare.
3. Aggiungere ovunque da 10 microlitri di 500 microlitri di campione di questo....

Risultati

Risultati sono mostrati in Figura 3 per l'applicazione di tali saggi colorimetrici ai composti di riferimento noti. Rappresentativi dati qualitativi sono indicati per il Benedetto (a), orcinol Bial di (b), e Dische di difenilammina (c) saggi, e le curve standard per questi tre saggi sono illustrati nella Figura 4. In pannelli 3 (ac), i pannelli di sinistra mostra positive / negative esperimenti di controllo utilizzando analiti opportunamente reattivi / non reattivi; questi risultati.......

Discussione

I saggi colorimetrici presentati qui offrono un approccio semplice per valutare rapidamente la natura chimica di miscele biomolecolari, come si incontrano quando purificare proteine, RNA o complessi di cellule intere lisato in preparazione per ulteriori studi. Come biologia strutturale persegue assemblee più nativa, come le sfide progressivamente più grandi, come ad esempio l'eterogeneità del campione, sarà posta dai complessi complesse e multi-componente. Supramolecolari sono spesso solo marginalmente stabile.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Reagente o attrezzature	Fornitore / società	Numero di catalogo	Commenti, note
Sodio carbonato anidro	Fisher Scientific	S263
Sodio citrato diidrato	Sigma	S-4641
Di rame (II) solfato pentaidrato	VWR	VW3312-2
Monoidrato orcinol	Sigma-Aldrich	O1875
HCl concentrato	VWR	BDH3030
Cloruro ferrico esaidrato	Sigma	F-2877
Difenilammina	Aldrich	112763
Acido acetico glaciale	Fisher Scientific	A28
Acido solforico	Sigma-Aldrich	258105
Etanolo	Koptec	V1101
Ribosio	Sigma	R-7500	prep a 1% w / v in H 2 O
L'acido ribonucleico da lievito di birra (S. cerevisiae)	Sigma	R6750	preparazione a 10 mg / ml in H 2 O, conservare a -20 ° C
Acido desossiribonucleico (sale sodico), da timo di vitello	Sigma	D1501	preparazione a 10 mg / ml in H 2 O, conservare a 4 ° C
			Reagenti, strumentazione e sicurezza Materiali sono elencati nella following tabella nell'ordine in cui appaiono nella sezione Protocollo. Se non specificato diversamente (sopra), tutti i reagenti possono essere conservati a temperatura ambiente e l'illuminazione. Per tutti gli articoli non elencati di seguito (per esempio, provette da microcentrifuga), la marca solita / modello / varietà trovato in un laboratorio biochimico di serie può essere utilizzata (ad esempio, di marca Eppendorf da 1,5 ml microcentrifuga tubi). Standard di provette per microcentrifuga plastica deve essere utilizzato per operazioni che coinvolgono centrifugazione (ad esempio, al materiale particolato sedimenti vicino alla fine di ciascun protocollo). Nessuna particolare materiale è preferibile, purché i tubi possono essere sigillata; le provette di polipropilene tipici presenti nei laboratori di biochimica funziona bene. In termini di problemi di sicurezza e di smaltimento dei rifiuti, le precauzioni standard di laboratorio (occhiali di sicurezza, cappe) deve essere esercitata nel pre-sbucciatura, lavorare con, e lo smaltimento di soluzioni contenenti concentrato acetico, cloridrico o solforico. Per i reagenti organici come orcinol o diphenylamine, guanti di nitrile sono preferibili al lattice comune (gomma naturale) varietà.