Microfluïdische-based Electrotaxis voor On-demand Kwantitatieve analyse van<em> Caenorhabditis elegans</em> 'Locomotion
Summary
Een semi-automatische micro-electro-fluidisch methode om on-demand motoriek induceren in<em> Caenorhabditis elegans</em> Is beschreven. Deze methode is gebaseerd op het verschijnsel van neurofysiologische wormen reageren op milde elektrische velden ("electrotaxis") in microkanalen. Microfluïdische electrotaxis dient als een snelle, gevoelige, low-cost, en schaalbare techniek voor het screenen op factoren die van invloed neuronale gezondheid.
Abstract
De nematode Caenorhabditis elegans is een veelzijdige modelorganisme voor biomedisch onderzoek vanwege het behoud van ziektegenen en trajecten alsmede het gemak van de teelt. Verschillende C. elegans ziektemodellen gemeld, waaronder neurodegeneratieve aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson (PD), die de degeneratie van dopaminerge (DA) neuronen 1 omvat. Zowel transgenen en neurotoxische chemicaliën zijn gebruikt om DA neurodegeneratie en beweging defecten daaruit in wormen induceren, waardoor onderzoek naar de basis van neurodegeneratie en schermen voor genen en neuroprotectieve verbindingen 2,3.
Schermen in lagere eukaryoten, zoals C. elegans een doelmatige en economische manier op verbindingen en genen die neuronale signalering te identificeren. Conventionele schermen worden meestal handmatig uitgevoerd en gescoord door visuele inspectie, dus ze zijn tijd-consuming en gevoelig voor menselijke fouten. Bovendien, de meeste nadruk op celniveau analyse terwijl het negeren locomotievorm is een bijzonder belangrijke parameter voor bewegingsstoornissen.
We hebben een nieuwe microfluïdische screening systeem (figuur 1), dat controleert en kwantificeert C. ontwikkeld locomotion elegans 'met elektrisch veld stimuli binnen microkanalen. We hebben aangetoond dat een gelijkstroom (DC) veld robuust kan induceren on-demand voortbeweging naar de kathode ("electrotaxis") 4. Verwisseling van de polariteit van het veld zorgt ervoor dat de worm snel achteruit zijn richting ook. We hebben ook aangetoond dat defecten in dopaminerge en andere sensorische neuronen weg zwemmen respons 5. Daarom kunnen afwijkingen in neuronale signalering worden bepaald met beweging als read-out. De respons beweging kan nauwkeurig worden gekwantificeerd aan de hand van een reeks parameters zoals zwemmen snelheid, lichaam buigen frequentie en omkering tijd.
<p class = "jove_content"> Ons werk is gebleken dat de electrotactic reactie varieert met de leeftijd. Specifiek, jonge volwassenen reageren op een lager bereik van elektrische velden en bewegen sneller in vergelijking met larven 4. Deze bevindingen leidden ons naar een nieuwe microfluïdische apparaat om passief te sorteren wormen naar leeftijd en fenotype 6 ontwerpen.We testten ook de reactie van wormen gepulseerde gelijkstroom en wisselstroom (AC) elektrische velden. Gepulseerde DC velden van verschillende duty cycles effectief gegenereerd electrotaxis in beide C. elegans en zijn neef C. briggsae 7. In een ander experiment, symmetrisch wisselvelden met frequenties van 1 Hz tot 3 kHz geïmmobiliseerde wormen in het kanaal 8.
Uitvoering van het elektrische veld in een microfluïdische omgeving maakt een snelle en geautomatiseerde uitvoering van de electrotaxis assay. Deze benadering belooft high-throughput genetische en chemische schermen voor factoren vergemakkelijkeninvloed neuronale functie en leefbaarheid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Profiterend van de gedrags-fenomeen voor het eerst beschreven door Gabel en collega's en voortbouwend op de dielectrophoretic manipulatie werk van Chuang en collega's 11,12, onze microfluïdische gebaseerde electrotaxis test biedt een eenvoudige, robuuste en gevoelige methode om neuronale activiteit sonde in wormen met beweging als een uitgang. De analyse van de parameters verplaatsing mogelijk kwantitatieve vergelijking tussen de verschillende genotypen. De nauwkeurigheid van microkanaal fabricage en…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Canada Onderzoek Stoelen Program, Canadese Institutes of Health Research, en Ontario ministerie van Onderzoek en Innovatie bedanken door middel van hun Early Onderzoekers Award Programma voor financiële steun.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92×16 mm Petri dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hot plate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
Riferimenti
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
- Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
- Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , (2013).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116 (2011).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702 (2010).
- van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027 (2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77 (1), 71-94 (1974).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
- Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
- Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -. M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5 (2005).
- Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -. M. D. i., Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637 (2011).
