Microfluidic-baserte Electrotaxis for On-demand Kvantitativ analyse av<em> Caenorhabditis elegans</em> 'Locomotion
Summary
En semi-automatisert mikro-elektro-fluidic metode for å indusere on-demand bevegelse i<em> Caenorhabditis elegans</em> Er beskrevet. Denne metoden er basert på nevrofysiologisk fenomen av ormer reagerer på milde elektriske felt ("electrotaxis") inne microfluidic kanaler. Microfluidic electrotaxis fungerer som en rask, følsom, lave kostnader, og skalerbar teknikk til skjermen for faktorer som påvirker nevronal helse.
Abstract
De nematode Caenorhabditis elegans er en allsidig modell organisme for biomedisinsk forskning på grunn av sin bevaring av sykdomsrelaterte gener og gangstier samt sin enkle dyrking. Flere C. elegans sykdomsmodeller har blitt rapportert, inkludert neurodegenerative lidelser så som Parkinsons sykdom (PD), som innebærer degenerasjon av dopaminerge (DA) neuroner 1. Begge transgener og nevrotoksiske kjemikalier har blitt brukt til å indusere DA nevrodegenerasjon og påfølgende bevegelse defekter i ormer, noe som åpner for undersøkelser av grunnlaget for nevrodegenerasjon og skjermer for nervecellene gener og forbindelser 2,3.
Skjermer i lavere eukaryoter som C. elegans gi en effektiv og økonomisk måte å identifisere forbindelser og gener som påvirker nevrale signalering. Konvensjonelle skjermer er vanligvis utføres manuelt og scoret ved visuell inspeksjon, derfor de er tid-consuming og utsatt for menneskelige feil. I tillegg, mest fokus på cellenivå analyse og overser bevegelse, som er en spesielt viktig parameter for bevegelsesforstyrrelser.
Vi har utviklet en ny microfluidic screening system (Figur 1) som kontrollerer og kvantifiserer C. elegans 'bevegelse ved hjelp av elektriske feltet stimuli inne microchannels. Vi har vist at en likespenning (DC)-feltet kan robustly indusere on-demand bevegelse mot katoden ("electrotaxis") 4. Reversere feltets polaritet fører til at ormen å raskt snu retningen også. Vi har også vist at defekter i dopaminerge og andre sensoriske nerveceller endre svømming respons fem. Derfor kan unormalt i nevrale signalering bestemmes ved hjelp av bevegelse som en skrivebeskyttet ut. Bevegelsen respons kan være nøyaktig kvantifiseres ved hjelp av en rekke parametere som svømming hastighet, kroppen bøyd frekvens og reversering tid.
<p class = "jove_content"> Vårt arbeid har avdekket at electrotactic responsen varierer med alderen. Spesielt unge voksne svare på et lavere spekter av elektriske felt og bevege seg raskere i forhold til larver fire. Disse funnene førte oss til å designe en ny microfluidic enhet til passivt sorterer ormer etter alder og fenotype seks.Vi har også testet responsen av ormer på pulserende DC og vekselstrøm (AC) elektriske felt. Taktet felt av ulike avgifter sykluser effektivt genererte electrotaxis både C. elegans og sin fetter C. briggsae 7. I et annet eksperiment, immobilisert symmetriske AC felt med frekvenser fra 1 Hz til 3 kHz ormer inne i kanalen 8.
Gjennomføring av det elektriske felt i et mikrofluidteknisk miljø muliggjør rask og automatisert utførelse av electrotaxis analysen. Denne tilnærmingen lover å legge til rette for høy gjennomstrømming genetiske og kjemiske skjermer for faktorerpåvirker nevronal funksjon og levedyktighet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Å dra nytte av atferdsmessige fenomen først beskrevet av Gabel og kolleger og bygge på dielectrophoretic manipulasjon arbeidet med Chuang og kolleger 11,12, gir vår mikrofluidteknisk-baserte electrotaxis analysen en enkel, robust og sensitiv metode for å sondere neuronal aktivitet i ormer som bruker bevegelse som en utgang. Analysen av bevegelse parametere tillater kvantitativ sammenligning mellom forskjellige genotyper. Presisjonen av microchannel fabrikasjon og elektrisk felt anvendelse sammen tilveieb…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Canada Research Stoler Program, kanadiske Institutes of Health Research, og Ontario Ministry of Research and Innovation gjennom sin Tidlig Forskere Award Program for økonomisk støtte.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
| Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
| Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
| SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
| SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
| 92×16 mm Petri dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
| Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
| Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
| Hot plate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |
Riferimenti
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
- Kuwahara, T., Koyama, A., et al. A systematic RNAi screen reveals involvement of endocytic pathway in neuronal dysfunction in a-synuclein transgenic. 17 (19), 2997-3009 (2008).
- Su, L. J., Auluck, P. K., et al. Compounds from an unbiased chemical screen reverse both ER-to-Golgi trafficking defects and mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease models. Dis. Model Mech. 3 (3-4), 194-208 (2010).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrotaxis of Caenorhabditis elegans in a microfluidic environment. Lab Chip. 10 (2), 220-226 (2010).
- Salam, S., Ansari, A., et al. A microfluidics set up to study neuronal degeneration and identification of neuroprotective compounds in C. elegans. , (2013).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Electrical sorting of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 12 (10), 1831-1840 (2012).
- Rezai, P., Salam, S., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Effect of pulse direct current signals on electrotactic movement of nematodes Caenorhabditis elegans and Caenorhabditis briggsae. Biomicrofluidics. 5 (4), 044116 (2011).
- Rezai, P., Siddiqui, A., Selvaganapathy, P. R., Gupta, B. P. Behavior of Caenorhabditis elegans in alternating electric field and its application to their localization and control. Appl. Phys. Lett. 96 (15), 153702 (2010).
- van Ham, T. J., Thijssen, K. L., Breitling, R., Hofstra, R. M., Plasterk, R. H., Nollen, E. A. C. elegans model identifies genetic modifiers of alpha-synuclein inclusion formation during aging. PLoS Genet. 4, e1000027 (2008).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetica. 77 (1), 71-94 (1974).
- Gabel, C. V., Gabel, H., Pavlichin, D., Kao, A., Clark, D. A., Samuel, A. D. Neural circuits mediate electrosensory behavior in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 27 (28), 7586-7596 (2007).
- Chuang, H. -. S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans. Lab Chip. 11 (4), 599-604 (2011).
- Cronin, C. J., Mendel, J. E., Mukhtar, S., Kim, Y. -. M., Stirbl, R. C., Bruck, J., Sternberg, P. W. An automated system for measuring parameters of nematode sinusoidal movement. BMC Genet. 6, 5 (2005).
- Manière, X., Lebois, F., Matic, I., Ladoux, B., Meglio, J. -. M. D. i., Hersen, P. Running worms: C. elegans self-sorting by electrotaxis. PLoS One. 6 (2), e16637 (2011).
