Um método de micro-electro-fluídico semi-automatizado para induzir a demanda de locomoção em<em> Caenorhabditis elegans</em> É descrito. Este método baseia-se no fenómeno neurophysiologic de vermes respondem a campos eléctricos ligeiros ("electrotaxis") no interior de canais microfluidicos. Microfluidic electrotaxis serve como um baixo custo, e escalável técnica rápida, sensível, para triagem de fatores que afetam a saúde neuronal.
Os nemátodo Caenorhabditis elegans é um organismo modelo versátil para a investigação biomédica devido à sua conservação dos genes e vias relacionadas com a doença, bem como a sua facilidade de cultivo. Vários C. elegans modelos da doença têm sido relatados, incluindo desordens neurodegenerativas tais como a doença de Parkinson (PD), que envolve a degeneração de dopaminérgica (DA) neurónios 1. Ambos os transgenes e produtos químicos neurotóxicos têm sido utilizados para induzir a neurodegeneração promotor e consequentes defeitos de circulação em vermes, permitindo investigações sobre a base da neurodegeneração e telas para os genes e compostos neuroprotectores 2,3.
Telas em eucariotos mais baixas, como C. elegans proporcionar um meio eficiente e econômico para identificar os compostos e os genes que afetam a sinalização neuronal. Telas convencionais normalmente são realizados manualmente e marcado por inspeção visual e, conseqüentemente, eles são tempo-consuming e propenso a erros humanos. Além disso, a maior enfoque na análise nível celular, ignorando a locomoção, que é um parâmetro muito importante para desordens de movimento.
Desenvolvemos um novo sistema de rastreio de microfluidos (Figura 1), que controla e quantifica C. locomoção elegans 'usando estímulos campo elétrico no interior de microcanais. Mostrámos que um campo de corrente contínua (DC) pode induzir robustamente on-demand locomoção para o cátodo ("electrotaxis") 4. Invertendo a polaridade do campo faz com que o worm para reverter rapidamente a sua direção. Também mostrámos que os defeitos em neurónios sensoriais e outros dopaminérgicos alterar a resposta de natação 5. Portanto, anormalidades na sinalização neuronal pode ser determinada utilizando a locomoção como uma leitura. A resposta de movimento podem ser quantificados com precisão, utilizando uma gama de parâmetros, tais como velocidade de natação, corpo frequência de flexão e do tempo de reversão.
<p class = "jove_content"> O trabalho revelou que a resposta electrotactic varia com a idade. Especificamente, os jovens respondem a uma menor variedade de campos elétricos e se mover mais rápido em comparação com larvas de 4. Estes resultados levaram-nos a projetar um novo dispositivo micro para classificar passivamente vermes por idade e fenótipo 6.Também testamos a resposta de vermes para pulsado DC e alternada campos de corrente elétrica (AC). DC campos pulsados de vários ciclos electrotaxis efetivamente gerados, tanto C. elegans e seu primo C. briggsae 7. Numa outra experiência, os campos AC simétricas, com frequências que vão de 1 Hz a 3 kHz vermes imobilizada no interior do canal 8.
Implementação do campo elétrico em um ambiente de microfluídica permite a execução rápida e automatizada do ensaio electrotaxis. Esta abordagem promete facilitar telas genéticas e químicas de alto rendimento para os fatoresafetando a função neuronal e viabilidade.
Aproveitando-se do fenômeno comportamental descrita pela primeira vez por Gabel e colegas e com base no trabalho de manipulação dieletroforética de Chuang e colegas 11,12, nosso ensaio electrotaxis baseado em microfluídica fornece um método fácil, robusto e sensível para investigar a atividade neuronal em vermes usando o movimento como uma saída. A análise dos parâmetros de movimento permite a comparação quantitativa entre os diferentes genótipos. A precisão de fabrico de microcanais e aplicaç…
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer ao Conselho de Ciências Naturais e Pesquisa de Engenharia do Canadá, Canadá programa de Cátedras de Pesquisa, Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde, e Ontário Ministério da Investigação e da Inovação através de seu Programa de investigadores em início Prêmio de apoio financeiro.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Acetone | CALEDON Labs | 1200-1-30 | |
Methanol | CALEDON Labs | 6700-1-30 | |
Isopropanol | CALEDON Labs | 8600-1-40 | |
SU-8 | Microchem Corp. | Y131273 | SU-8 100 |
SU-8 Developer | Microchem Corp. | Y020100 | |
92×16 mm Petri dish | Sarstedt | 82.1473.001 | |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | Contains elastomer base and curing agent | |
Function generator | Tektronix Inc. | Model AFG3022B | |
Amplifier | Trek Inc. | Model 2210-CE | |
Syringe pump | Harvard Apparatus | 70-4506 | Model 11 ELITE |
Hot plate | Fisher Scientific | 11675916Q | Model HP131725Q |