En Sebrafisk modell av diabetes mellitus og metabolsk Memory

Summary

Metabolsk minne er fenomenet der diabetiske komplikasjoner vedvarer og fremgang uhindret selv etter euglycemia oppnås farmasøytisk. Her beskriver vi en diabetes mellitus sebrafisk modell som er unikt ved at det gir mulighet for undersøkelse av mitotisk overførbare epigenetic komponenter av metabolsk minne<em> In vivo</em>.

Abstract

Diabetes mellitus påvirker tiden 346 millioner individer, og dette er anslått å øke til 400 millioner innen 2030. Bevis fra både laboratoriet og storskala kliniske studier har avdekket at diabetiker komplikasjoner fremgang uhindret via fenomenet metabolsk minnet selv når glykemisk kontroll er farmasøytisk oppnådd. Genekspresjon kan stabilt endres gjennom epigenetic endringer som ikke bare tillater celler og organismer til å reagere raskt skiftende miljømessige stimuli men også gi muligheten av cellen å "huske" disse møter når stimulans er fjernet. Som sådan, er rollene som disse mekanismene spiller i den metabolske minne fenomenet nå undersøkt.

Vi har nylig rapportert utvikling av en sebrafisk modell av type I diabetes mellitus, og karakterisert denne modell for å vise at diabetisk sebrafisk ikke bare vise de kjente sekundære komplikasjoner inkludert endringer forbundetmed diabetisk retinopati, diabetisk nefropati, og nedsatt sårtilheling men også oppviser svekket halefinnen regenerering. Denne modellen er unik i at sebrafisk er i stand til å regenerere sin skadede bukspyttkjertelen og gjenopprette en euglycemic tilstand som ligner på hva som ville bli forventet etter transplantasjon menneskelige pasienter. Videre flere runder med halefinnen amputasjon tillate separasjon og studiet av rene epigenetic effekter i et in vivo-system uten potensielle kompliserende faktorer fra forrige diabetisk tilstand. Selv euglycemia oppnås etter bukspyttkjertelen regenerering, vedvarer diabetiker videregående komplikasjon fin regenerering og hud sårtilheling på ubestemt tid. I tilfelle av nedsatt fin regenerering, er denne patologi beholdes selv etter flere runder av fin regenerering i dattercellene fin vev. Disse observasjonene peker på en underliggende epigenetic prosess som eksisterer i den metabolske minnet staten. Her presenterer vi de metodene som trengs for å lykkes gennyttiggjøre de diabetiker og metabolske minne grupper av fisk og diskutere fordelene med denne modellen.

Introduction

Diabetes mellitus (DM) er en alvorlig og økende helseproblem som resulterer i redusert levetid på grunn av sykdom spesifikk mikrovaskulær (retinopati, nefropati, nevropati, nedsatt sårheling) og makrovaskulære (hjertesykdom og hjerneslag) komplikasjoner ^en. Gang startet, diabetiske komplikasjoner fortsette å utvikle seg uavbrutt selv når glykemisk kontroll oppnås ^2,3 og dette fenomenet har blitt kalt metabolsk minne eller arven effekt. Tilstedeværelsen av dette fenomenet ble anerkjent klinisk løpet av tidlig 1990-tallet som "The Diabetes Control og Komplikasjoner Trial (DCCT)" kommet, og siden har blitt støttet av flere ytterligere kliniske studier ^{4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14.} Dyremodeller av DM har vært avgjørende for funn knyttet til patho-fysiologi av diabetiske komplikasjoner og metabolsk minne. Faktisk var den utholdenhet av diabetiske komplikasjoner først dokumentert i en hjørnetann modell av diabetikerretinopati som siden er blitt støttet av flere linjer med eksperimentelle bevis ved hjelp av en rekke in vitro kultur systemer og dyremodeller ^{15,16,17,18,19,20,21.} Disse studiene viser tydelig at en første hyperglykemiske periode resulterer i permanente forandringer (inkludert avvikende genuttrykk) av målorganer / celler og mekanistisk antyder involvering av epigenome.

Epigenomes består av alle de kromatin modifikasjoner for en gitt celle type og er ansvarlig for en celle unike genuttrykk profil. Kromosomet modifikasjoner er dynamiske under utvikling, support celledifferensiering, er lydhør overfor ytre stimuli, er mitotisk stabilt arvet ^22,23 og kan bli forandret på sykdom ^24,25,26. Disse epigenetiske mekanismer inkluderer: poste translasjonelle histonmodifikasjonene, ikke-kanoniske histone variant inkludering i octomers, kromatin tilgang endringer gjennom DNA metylering, og genetuttrykk kontroll gjennom ikke-kodende mikro RNA ^27,28,29,30. Helt, epigenetiske prosesser tillate celler / organismer til å reagere raskt på endrede miljømessige stimuli ^31,32,33, de også gi muligheten for cellen å "huske" disse møter når stimulus er fjernet ^23,22. Derfor, som endrede genuttrykk profiler følge epigenetic prosesser er stabile i fravær av signalet (e) som startet dem og arvelig gjennom celledeling, har de fått stor interesse som underliggende molekylære mekanismene menneskelige patologier inkludert metabolsk minne. Resultatene som dukker opp i forbindelse med DM og epigenetikk parallelle fremskritt i andre sykdommer ved at en mengde epigenetic endringer indusert av hyperglykemi forårsaker bemerkelsesverdige vedvarende endringer i transcriptional nettverk av celler (anmeldt i ^{34,35,36,37,38).}

Sebrafisk har lenge vært en ledende modell organisme til study vertebrate utvikling men de siste 15 årene har sett en eksponentiell vekst i bruk denne organismen for studier av sykdom hos mennesker. ^39. Sebrafisk modeller av menneskelig sykdom har blitt etablert som dekker et bredt spekter av humane patologier inkludert genetiske sykdommer og ervervet sykdom ^40,41,42. De mange fordelene av sebrafisk over andre virveldyr modellorganismer inkluderer høy fruktbarhet, kort generasjonstid, åpenhet gjennom tidlig voksen alder, reduserte bokostnader og en rekke verktøy for genmanipulering. Videre, på grunn av den omfattende bevaring av genetiske trasé og cellulær fysiologi blant virveldyr og kapasitet til å utføre høy gjennomstrømning bedøve screenings har sebrafisk blitt brukt for farmasøytisk oppdagelse.

Vi har utviklet en voksen sebrafisk modell av type I diabetes mellitus ved hjelp diabetogenic stoffet, streptozocin. Vi har karakterisert denne modellen for å vise at diabetiker sebrafisk ingent bare vise den kjente humane sekundære komplikasjoner, men i tillegg, utviser nedsatt lem regenerering (halefinnen regenerering) som en konsekvens av den hyperglykemiske miljøet. I tillegg har vi rapportert at hyperglykemiske sebrafisk gå tilbake til normal glykemi innen 2 uker av narkotika fjerning skyldes regenerering av endogene pancreatic beta celler som resulterer i en fysiologisk normal glykemisk tilstand. Imidlertid, i kontrast, forblir lem regenerering i disse fiskene svekket i samme grad som i akutte diabetisk tilstand indikerer denne komplikasjonen vedvarer og er utsatt for metabolsk minne. Den viktigste drivkraften for generere denne modellen var å tilveiebringe et system for å studere mitotisk stabile epigenetic komponenter som støtter metabolske minnet fenomenet i fravær av bakgrunnsstøyen av forrige hyperglykemiske miljøet. Ved avslutningen av protokollen gitt her sebrafisk og eller selektive vev kan bli behandlet av en analyse egnet til researchers trenger. Vi har med hell brukt denne fremgangsmåten for å identifisere genom-wide vedvarende endringer i DNA metylering indusert av hyperglykemi som blir vedlikeholdt i den metabolske minnet staten ^21.

Vi føler at dette sebrafisk modell av type I diabetes mellitus har flere innovative fordeler fremfor andre modellsystemer for å undersøke metabolske minne. 1) Alle våre studier kan gjennomføres in vivo, og som den forrige hyperglykemiske fisken tilbake til euglycemia gjennom regenerering av endogen insulin produksjon, de krever ikke eksogene insulininjeksjoner. Derfor unngår dette de kompliserende toppene og dalene i glykemisk kontroll som kan oppstå hos dyr som krever eksogene insulin. 2) Som beskrevet ovenfor, er bakgrunnen stimulering fra forrige diabetiker tilstand (dvs. den fortsatte tilstedeværelsen av avansert glycation sluttprodukter og reaktive oksygen arter markører) eliminert og derfor kan man undersøke rent epigenetic faktorer av metabolsk minne. 3) Eksperimentene kan utføres raskt som det tar ca 80 dager fra diabetes induksjon inntil metabolsk minne undersøkelse. 4) halefinnen gjenfødelse er eksperimentelt svært approachable og gjør det lett å genetisk og eksperimentell manipulasjon som det er et stort utvalg av verktøy. 5) halefinnen regenerering gir en svært enkel og kvantifiserbare metode for å vurdere metabolsk minnet, og derfor vil tillate for fremtidig medisiner.

Protocol

Alle prosedyrer er utført i henhold til retningslinjene beskrevet i "Prinsipper for Laboratory Animal Care" (National Institutes of Health publikasjon no. 85-23, revidert 1985) og den godkjente Rosalind Franklin Institutional Animal Care og bruk komité dyr protokoll 08-19. Det er to viktige forkortelser som brukes i dette manuskriptet. 1) DM: refererer til fisk som er i en akutt (300 mg / dl) hyperglycemic staten og har vært i minst tre uker. 2) MM: refererer til fisk som var 21…

Representative Results

Type I diabetisk sebrafisk ikke bare vise de kjente sekundære komplikasjoner av retinopati og nefropati, men også vise en ekstra komplikasjon: nedsatt halefinnen gjenfødelse. Dette senere komplikasjon vedvarer på grunn av metabolsk minne i fisk som har restaurert normal glukose kontroll etter en hyperglycemic periode. I figur 2A (kontroll) og figur 2B (metabolsk minne) representative bilder av regenererende finnene som ble tatt ved 72 timer etter amputasjon presenteres. Underskuddet…

Discussion

Diabetes mellitus er en sykdom av metabolsk dysregulering, først diagnostisert som hyperglykemi, som til slutt resulterer i blodkarskader fører til mange komplikasjoner som alle vedvarer selv etter euglycemia oppnås om farmasøytisk intervensjon. Denne vedvarende komplikasjoner kalles metabolsk minne og flere nyere studier har undersøkt rollen epigenetic mekanismene spiller i dette fenomenet. Her har vi detaljert en protokoll som gjør det mulig for generering av både akutt diabetiker og metabolsk minne (restaurert…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Streptozocin	Sigma Aldrich	S0130
2 phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
Scalpel (size 10)	Fisher Scientific	089275A
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
½ cc syringe, with 27 1/2 gauge needle	Fisher Scientific	305620
QuantiChrome glucose assay kit.	Bioassay Systems	DIGL-100
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
Image J software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.