Vi beskriver her prosedyrene for utvinning og rensing av mRNA og metabolitter fra<em> Drosophila</em> Hoder. Vi søker disse teknikkene for å bedre forstå de cellulære forstyrrelsene underliggende nevronale degenerasjon. Disse metodene kan enkelt skaleres og tilpasses for andre "omic" prosjekter.
For det siste tiåret, har vi forsøkt å forstå de molekylære og cellulære mekanismene neuronal degenerasjon ved hjelp Drosophila som modell organisme. Selv fruktfluer gi åpenbare eksperimentelle fordeler, har forskning på nevrodegenerative sykdommer meste avhengig av tradisjonelle teknikker, inkludert genetisk interaksjon, histologi, immunfluorescens, og protein biokjemi. Disse teknikkene er effektive for mekanistisk, hypotese-drevet studier, som fører til en detaljert forståelse av rollen enkle gener i veldefinerte biologiske problemer. Imidlertid, nevrodegenerative sykdommer er svært komplekst og påvirke flere cellulære organeller og prosesser over tid. Bruk av nye teknologier og omics alder gir en unik mulighet til å forstå de globale mobilnettet forstyrrelsene underliggende komplekse sykdommer. Fleksibel modell organismer som Drosophila er ideelle for å tilpasse disse nye teknologiene på grunn av sin sterke Annotasjon og høy tractability. En utfordring med disse små dyrene, skjønt, er rensing av nok informative molekyler (DNA, mRNA, protein, metabolitter) fra svært relevante vev som fly hjerner. Andre utfordringer består av samle et stort antall fluer for eksperimentell replikater (kritisk for statistisk robusthet) og utvikle konsistente prosedyrer for rensing av høy kvalitet biologisk materiale. Her beskriver vi prosedyrer for innsamling tusenvis av fly hoder og utvinning av utskrifter og metabolitter til å forstå hvordan globale endringer i genekspresjon og metabolisme bidrar til neurodegenerative sykdommer. Disse prosedyrene er lett skalerbar og kan brukes til studiet av proteomikk og epigenomic bidrag til sykdom.
I det forrige århundre, har Drosophila vist seg å være et uvurderlig laboratorium verktøy for å undersøke dypere biologiske spørsmål, spesielt i utvikling, cellebiologi, genetikk og en nevrobiologi. Årsakene til denne suksessen er at fruktfluer er lett å manipulere, har en stadig voksende 18 verktøykasse, 21, 31, og har en relativt enkel genom med høy kvalitet merknad 26. Disse tekniske fordeler, kombinert med oppfinnsomhet og innovasjon innenfor fly samfunnet, har ført til brede vitenskapelige bidrag, som illustrert ved tildeling av tre Nobelpriser (1933, 1995, 2011). Mer nylig har Drosophila dukket opp som en relevant modell for å studere menneskelige sykdommer, først og fremst utviklingsforstyrrelser, medfødt immunitet, kreft og a neurodegenerering. Vi er spesielt interessert i å avdekke den cellulære og molekylære basis av nevrodegenerative sykdommer. Disse kompleks og mangfoldig conditions er knyttet til sammenstillinger, muligens oppløselige oligomerer, av unormalt brettede proteiner og er derfor lett modellert i fluer. Alle de store nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers, Parkinsons og Huntingtons sykdom, amyotrofisk lateral sklerose, flere ataxias, tauopathies, prionsykdommer, og andre sjeldne lidelser, er modellert i fluer i de siste femten år 23. Fly laboratorier har bidratt til å forstå disse sykdommene hovedsakelig ved å utnytte dyktighet av Drosophila genetikk å identifisere nye gener involvert i nevrotoksisitet av de sykdomsfremkallende proteiner. Når nye gener som er relevante for den nevrotoksiske kaskade identifiseres, blir effekten vanligvis analysert av tradisjonelle tilnærminger, inkludert histologi å fastslå mønstre av degenerasjon, immunofluorescence å bestemme protein distribusjon og mobilnettet patologi, og biokjemiske analyser for å vurdere mengde og type unormale protein conformations . Til slutt, atferdioral analyse fungerer som en funksjonell avlesning av sykdom utfall. Disse veletablerte teknikker er blitt utnyttet for å undersøke bidraget av en eller noen få kandidatgener til sykdommen prosessen, inkludert oksidativt stress og mitokondrielle 13 dysfunksjon, transkripsjonelle dysregulering 9, 27, 30, aberrant aksonal transport og synaptisk aktivitet 14, unormal RNA biologi 9, hindret feilregulert celle 29 signalering, ER dyshomeostasis 6, cellular proteostasis 33, og mange andre 23. Det er imidlertid ikke klart hvordan disse toksiske proteiner kan forstyrre samtidig med flere sammenhengende trasé, er hva temporale Rekkefølgen av disse endringer, og hva som er den relative bidraget til hver vei til patogenesen. Tiår med forskning fokusert på enkelt gen, har hypotesen-drevet tilnærminger i både mennesker og dyremodeller ført til en ufullstendig, forvirrende bilde av de cellulære mekanismene som forårsakerneurodegeneration. Gjeldende dårlig forståelse av de eksakte mekanismene som disse giftige protein forsamlinger forårsake nevropatologi er en viktig begrensning for utviklingen av sykdomsmodifiserende behandling.
Vi er nå interessert i anvendelsen av nye tilnærminger til å forstå hvordan disse sykdomsfremkallende proteiner indusere globale mobilnettet forstyrrelser. Advent av omics æra gjør den dype sondering av komplekse biologiske problemer ved hjelp av avanserte high-throughput teknologi, som kan føre til effektive sykdom behandlinger i nær fremtid. Genuttrykk (transcriptomics) studier ble etablert etter ferdigstillelse av flere genomsekvenser siden høy kvalitet merknad kan forutsi de fleste transkripsjoner. Den nye søknaden av neste generasjons sekvensering til karakterutskriften analyse (RNA-seq) har gitt nye fordeler og muligheter i forhold til mikromatriser, inkludert en upartisk tilnærming, forbedret kvantitative rekkevidde, og reduserte kostnader 32.Vi ønsker å utnytte fordelene av RNA-seq å bedre forstå den vanligste formen for dominant arvelig ataksi, spinocerebellar ataksi type 3 (SCA3) eller Machado-Joseph sykdom. SCA3 er en monogen, dominant sykdom med full penetrans, forårsaket av en CAG trinucleotide ekspansjon i Ataxin3 genet (ATXN3) 16. Denne mutasjonen fører til produksjon av Atxn3 protein med en lang polyglutamine (polyQ) spor som gjør den utsatt for aggregat. Siden mutant Atxn3 er nevrotoksisk agent i SCA3 ansvarlig for alle sykdomsrelaterte forstyrrelser, er dette en ideell sykdom for å bruke disse nye omic tilnærminger. I tillegg var SCA3 en av de tidligste nevrodegenerative sykdommer modellert i fluer 34.
Mens du setter på plass prosedyrer for å samle inn store mengder fly hoder for RNA-seq, innså vi at vi kunne bruke det samme materialet for å utføre globale studier av andre informative molekyler. Blant andre fremvoksende disciplinjer, proteomikk, epigenomics og metabolomics tillate undersøkelse av mobilnettet patologi ved en dybde som ikke tidligere oppnådd, men ikke uten utfordringer. I motsetning til mRNA, er katalogen av proteiner og metabolitter ganske ufullstendig på dette tidspunktet på grunn av økt vanskelighetsgrad i å forutsi alle mulige skjøting varianter og enda mer gåtefulle opprinnelse av alle normale og sykdomsfremkallende metabolitter. Stor satsing er for tiden i gang med å katalogisere proteiner i mange organismer og i sykdomstilstander. For dette, ønsket vi å fokusere på bidrag av endrede metabolitter til SCA3 patogenesen ved hjelp av en enkel organisme, for eksempel Drosophila. Dette er et relativt nytt og lovende feltet, spesielt med den nylige introduksjon av nukleær magnetisk resonans (NMR), som gir høy reproduserbarhet og ikke ødelegger prøvene 5, 24. Vi foreslår at metabolitt profilering kan bidra til å identifisere biomarkører og sykdomsmekanismer innblandet i neurodegeneratipå.
Et viktig hensyn med disse omic prosjektene er at de krever store, ensartede prøver (200 fly hoder) samt presise rensing teknikker for å minimere eksperimentell variasjon. Vi begynte å samle fluer i henhold til prosedyrene vi hadde brukt tidligere for microarrays og også brukt nylig for RNA-seq 12. Men vi snart oppdaget en rekke problemer knyttet til misexpressing de SCA3 konstruksjoner. Først måtte vi velge en Gal4 driver for disse eksperimentene 4, der målet vev for analyse var hjernen. Det opplagte valget ville være en pan-neural driver siden SCA3 er en hjernesykdom. Men siden vi har tenkt å samle mRNA og metabolitter fra hele hodet, ville dette alternativet produsere blandet materiale fra vev uttrykke og ikke-uttrykker konstruksjoner. For å generere homogene prøver der alle cellene uttrykker de konstruerer, besluttet vi å bruke en svak, men allestedsnærværende driver linje, daughterless (da)-Gal4. Interestingly, mange av gener involvert i nevrodegenerative sykdommer, inkludert ATXN3 20, har en bred fordeling, noe som gjør valget av allestedsnærværende uttrykk hensiktsmessig. Deretter møtte vi et annet problem: allestedsnærværende uttrykk for patogene Atxn3-78Q forårsaket dødelighet under utvikling. Å omgå denne dødelighet, innlemmet vi Gal80 ts å kontrollere timelige aktivering av Gal4 19. Dette tillot oss å samle de eksperimentelle fluer, alder dem i opptil 20 dager, fryse dem, og behandle sine lyofiliserte hoder for enten RNA (TRIzol) eller metabolitten (metanol-kloroform) ekstraksjon (figur 1). Vi har allerede brukt denne protokollen for å oppnå prøver for transcriptomic og metabolomic analyser, men det er andre åpenbare bruksområder for denne teknikken (f.eks proteomikk eller nevro-peptidomic analyser).
Eksperimentell oversikt: Det overordnede målet med disse protokollene er å støtte innsamling av consistent prøver av fly hoder for utvinning av vitnemål og metabolitter. Den spesifikke målet med disse prosedyrene er å få fluer uttrykker Atxn3-27Q og Atxn3-78Q (non-patogene og sykdomsfremkallende eksperimentelle konstruksjoner) samt lacZ (kontroll konstruere), hvor en enkelt prøve består av 200 fly hoder. Selv dagens teknologi tillater analyse av svært små prøver, inkludert enkeltceller 28, samles vi 200 hoder å eliminere eksperimentell, biologiske og tekniske variasjon, og dermed tillater oss å identifisere de celleforandringer assosiert med sykdommen prosessen med høy statistisk sikkerhet. Denne tilnærmingen er designet for å oppdage bare de endringer i genuttrykk som er konsistent i befolkningen, regi oss mot de mest kritiske stier kjøring degenerasjon. Siden vi er interessert i aldersavhengige endringer i hodene på disse fluene, ble hver genotype oppnådd på 1, 10 og 20 dager gammel.
En grunnleggende del av disseglobale analyser er produksjonen av biologiske replikater som støtter en robust statistisk analyse. Vår tidligere erfaring med mikromatriser og RNA-seq tyder på at analyse av biologiske prøver i tre eksemplarer gi sterk statistisk signifikans av de 11 data, 12. Vi beskriver i punkt 1) hvordan å generere en enkelt biologisk replikere (Rep 1) for hver genotype og tidspunkt. Disse prosedyrene kan gjentas for å generere Reps 2 og 3, eller gjort i parallell, så lenge hver Rep er riktig identifisert. Selv om tre representanter er målet, og setter en fjerde (eller femte selv) Rep er sterkt anbefalt å dekke problemstillinger knyttet til lav avkastning, tap av fluer under aldring, eller utilsiktet tap av materiale (fluer, hoder, eller RNA) i ett eller flere prøver.
Vi fant at ti kors (flasker identifisert av bokstaver AJ) produsert nok avkom til å få 200 hoder / genotype / tidspunkt. Ekstrem forsiktighet må brukes for å unngå forvirring, siden et stort antall flaskerre nødvendig for å få en Rep (10 flasker x 3 genotyper x 3 tidspunkter = 90 flasker). For dette, utpekt vi hver flaske med genotype, tidspunkt og flaske brev. For eksempel refererer SCA3-27Q 20E til den femte flasken (av ti) av fluer uttrykker Atxn3-27Q eldet i 20 dager. Når avkommet Eclose er fluene opprettholdt i separate hetteglass merket med en unik identifikator.
Vi opprettholdt antallet fluer oppnådd for hver prøve, flaske, og returpunkt (morgen og kveld) i et Excel-regneark. Vi revidert antall fluer pr ampulle før frysing for å ta hensyn til dødelighet og escapees. Fra disse siste teller, kan ampuller legge 200 fluer være lett plassert før du åpner fryseren, og dermed bidra til bevaring av prøvene. Siden fluer samlet inn fra en flaske kan bare brukes på én Rep, maksimert vi deres bidrag per biologisk replikere, selv om alle representanter inneholdt fluer fra flere flasker. Vi har reservertfluene fra flasker som ikke brukes i deres planlagte Rep for andre representanter, som erstatning prøver, eller for andre relaterte eksperimenter (western blot, qPCR).
Bygge på vår tidligere erfaring i 11 transcriptomics, 12, metabolisme 15, og nevrodegenerative sykdommer 6, 8, presenterer vi her en ny protokoll for å samle tusenvis av fly hoder med voksen-konkret uttrykk for sykdomsfremkallende gener, og rensende mRNA og metabolitter for RNA- seq og NMR spektroskopi, henholdsvis. Naturen av disse eksperimentene kreves inkorporering av flere nyvinninger før flua samlingen, inkludert valg av en allestedsnærværende Gal4 linje og bruk av tidsmessig regulering av genekspresjon. Angående Gal4, allestedsnærværende uttrykk for transgener var avgjørende av to grunner. Først, et stort antall gener involvert i nevrodegenerative sykdommer, inkludert ATXN3, huntingtin, amyloid forløper protein og Superoxide dismutase 1, blant andre, er allment uttrykt i neuronal og glial celler samt i andre celletyper utenfor nervesystemet. Vi ønsket åfullstendig modellere dette aspektet av biologien disse patogene gener ved å analysere konsekvensene av allestedsnærværende uttrykk stedet for å fokusere bare på nevrale uttrykk. Sekund, er det ikke mulig å samle fly hjerner i stort antall, men vi kan gjøre det med fly hoder (over 200 i tre eksemplarer per tilstand) 11, 12. Siden homogenisering av hele hodet blander neural og ikke-nervevevet blir allestedsnærværende transgene uttrykk kritisk for å oppnå ensartede RNA og metabolitter fra populasjoner av celler som uttrykker de samme transgener. Det er viktig å merke seg at da-Gal4 ble valgt for sin ganske jevn fordeling, ikke på grunn av sin høye uttrykk nivå, selv om en fersk rapport antydet at da-Gal4 ikke kan være helt allestedsnærværende 25. Vi hadde tidligere vurdert andre allestedsnærværende Gal4 linjer, inkludert arm-, Tub-, og lov-Ga4, men de alle viste komplekse uttrykk mønstre i voksen CNS og muskler, noe som gjør dem mindre endequate for denne studien. Faktisk viste immunfluorescens hos voksne hjerner at da-Gal4 induserer utbredt men svak uttrykket, som akkumuleres bare ved høye nivåer i hjernen sentre består av noen få tusen axoner og i noen få store nevroner (figur 2). Selv om uttrykket nivåer av constructs var lav, disse forholdene dramatisk redusert overlevelse i en polyQ-avhengig måte. Dette uttrykket dynamikk oppfylt våre behov, samtidig uttrykk nivåer lave, noe som var viktig for å observere de langsomme, progressive mobilnettet endringer forårsaket av nevrotoksiske proteiner.
En forutsigbar konsekvens av å indusere allestedsnærværende uttrykk for nevrotoksiske proteiner var at det forårsaket dødelighet før voksen eclosion. Heldigvis, denne komplikasjonen forbikoblet med bruk av Gal80 ts. Som omtalt ovenfor, nådde genekspresjon maksimale nivåer ca 48 timer etter den temperatur skift, som passer godt med den tiden FRAmeg av forsøket. En ytterligere fordel med å bruke Gal80 ts var at, i motsetning til eksperimenter hvor nevrotoksisk proteiner er konstitutivt uttrykte pan-nevralt, var det ingen ekspresjon under utviklingen av nervesystemet. Dermed skapte bruk av Gal80 ts en "ren" bakgrunn der nervesystemet ikke var eksponert for giftige aktiviteter av disse nevrotoksiske proteinene under utviklingsstadier. Etter vårt syn, resulterte aktivering av genuttrykk hos voksne i en bedre modell for denne klassen av voksen-angrep patologi. Men Gal80 ts også innført noen komplikasjoner forbundet med temperaturendringer. En var at voksende fluer ved lave temperaturer (18-20 ° C) forsinket livssyklusen, gjør forsøkene betydelig lengre. Dessuten er det velkjent at voksende fluer ved høye temperaturer (29-31 ° C) akselererer deres metabolisme, som illustrert ved den forkortede levetid sammenlignet fluer alderen ved 25 ° C. Since de transcriptional og metabolske studier vil bli utført i fluer i alderen ved høy temperatur, kan vi forvente å se viktige endringer i cellulære stress-trasé og energiomsetning. Dette er grunnen til at det var så viktig å introdusere to kontroller i forsøket, en med ikke-patogene Atnx3-27Q og en uavhengig kontroll uttrykker LacZ. Disse kontrollene vil gi en baseline for genuttrykk og metabolske forandringer assosiert med høy temperatur, slik at vi kan identifisere disse endringene direkte knyttet til uttrykk for giftige Atxn3. Samlet har vi innført flere endringer i innsamling av fluer som gir en rekke fordeler – og noen ulemper (temperatur problemer og neste avsnitt) – for å studere voksen alder, progressive sykdommer.
Selv om tidsmessig regulering med Gal80 ts var en nyttig tillegg er det også innført en uventet komplikasjon. Mens generere fluene bærer både Gal80 ts ennd da-Gal4 konstruerer i en stabil lager, la vi merke til at flyr dobbelt homozygot for begge konstruerer var levedyktig, men sterilt. Siden homozygot Gal80 ts og da-Gal4 stammene var levedyktig og fruktbar av seg selv, er det ikke klart hvorfor kombinasjonen viste lav fruktbarhet. Det har vært kjent i noen tid at Gal4 er litt giftig for Drosophila vev 22. Det er mulig, da, at det heterologe uttrykket av gjær transkripsjonelle repressor Gal80 bidro til giftigheten av Gal4 ved å gripe, potensielt med endogent transkripsjonelle maskineri. Dette toksisitet kan bli forverret av den allestedsnærværende distribusjon av Gal4 under kontroll av da, et gen som spiller en viktig rolle i tidlig utvikling og seksuell besluttsomhet. Uavhengig av de underliggende årsakene til sterilitet, utvidet vi Gal80 ts; da-Gal4 fluer ved å opprettholde en balanseaksel kromosom enn da-Gal4 samtidig som homozygosity for Gal80 t s, noe som tyder på at Gal4 er en mer kritisk bidragsyter til sterilitet. Denne løsningen var nøkkelen fordi vi brukte hundrevis av disse menn annenhver uke for å krysse med hver av de UAS transgener. Imidlertid krysser bærer en balanseblokk opprettet merarbeid ved valg av den riktige avkom. Bare fjerdedeler (25%) av avkom ble oppsamlet (hunner, ikke-balansesleider), som legges valg tillegg reduserte utbyttet per flaske, og økt antall flasker som trengs for å oppnå minst 200 fluer pr genotype / replikere / tid punktet. Total, selv om innsamling av fluer ble tidkrevende på grunn av de store sett trengs, er vi sikre på at det å studere celleforandringer bare noen timer etter å slå på uttrykket av sykdomsfremkallende gener overalt vil identifisere nye og interessante prosesser involvert i progressive neuronal tap.
Når den genetiske design var på plass, vi betalte spesiell oppmerksomhet tileksperimentelle manipulasjoner som kan introdusere biologiske variasjoner. Først, vi bare samlet jomfruelige kvinner for å sikre homogeniteten av prøvene, selv om dette betydde å kaste bort hanner og sjekke for avkom to ganger om dagen. Under aldring, ble ikke mer enn 12 fluer oppbevares i samme hetteglasset unngå overbefolkning og stress. Også før frysing, ble fluer overført til kryorør uten bedøvelse og fikk lov til å komme seg fra overføringen for 30 min. Disse tilsynelatende trivielle faktorer kan påvirke genuttrykk og metabolisme, innføre variasjon i den endelige analysen som ikke ville være relevant for eksperimentet.
For å sikre kvaliteten på de frosne materialer (hoder, RNA, og metabolitter), betalte vi spesiell oppmerksomhet til hver detalj som kan bidra til vev degradering. Siden fluene er overført til kryorør i små tall (opptil 12 fluer per hetteglass), måtte vi hente mange hetteglass for innsamling av 200 hoder. Disse manipulasjoner var den med ekstrem forsiktighet i et kaldt rom med tørris og flytende nitrogen. Samlingen av fluer, separasjon av hoder, og rensing av informative molekyler er for tidkrevende å oppdage at materialet var degradert på slutten av denne lange prosess. I tillegg til å sikre at materialet beholder sin kvalitet, beskriver denne protokollen flere skritt som maksimerer utbyttet av RNA og metabolitter, inkludert frysetørking og perle juling. Disse trinnene er ikke nødvendig for normal utdrag for RT-PCR eller kvantitativ PCR fra hele fluer, men de er kritiske for konsekvent rensing fra små prøver som fly hoder. Vi fastslått at andre trinn påvirker utbyttet av RNA. For eksempel produserte eldre fluer betydelig færre RNA enn yngre fluer, uavhengig av genotype. Denne observasjon antydet at aldring ved høy temperatur induserer dramatiske endringer. Også trekke RNA fra 100 hoder var faktisk mer effektivt enn fra 200 hoder, så vi gikk for å rense i to batches på 100 per prøve, bare for å kombinere dem etter kontroll av kvalitet med Bioanalyzer. Også, virket kolonner for mRNA rensing å mette lett, slik at mengden av total RNA brukt per kolonne må optimaliseres.
Metabolitter er en god blanding av små molekyler, slik kvalitetskontroll er vanskeligere enn med DNA, RNA eller proteiner. Dessverre er det ingen komplett katalog av metabolitter for enhver dyremodell på denne tiden, noe som kan være i endring i de neste årene takket være bruk av flere teknologiske nyvinninger, blant annet NMR-spektroskopi og utvidet bruk av væskekromatografi – massespektrometri ( LC-MS). Selv om NMR er mindre sensitiv enn MS, viser det mange lovende fordeler, inkludert ingen ødeleggelse av prøver, ingen analytiske prosedyrer som introduserer bias (LC), og høy reproduserbarhet som tillater statistisk sammenligning av representanter og flere eksperimentelle betingelser 24. Således kan prøven væretestes for å verifisere observasjoner eller re-analysert ved LC-MS til å validere NMR data. Her viste vi foreløpige NMR data fra fluer som vi bruker til å lage en katalog av metabolitter i Drosophila. Denne informasjonen vil være avgjørende for å bestemme hvordan uttrykk for patogene gener endrer normal metabolisme, åpner et nytt vindu for å fremme forståelse cellulære mekanismene bak nevrodegenerative sykdommer.
Nylig nye omic teknologier tilby den beste muligheten til å studere nevrodegenerative sykdommer på et detaljnivå som tidligere ikke oppnådd. Kanskje den største hinderet for å overvinne disse high-throughput studier er den trofaste samling av reproduserbare prøver som kan analyseres med svært følsomme metoder. Prosedyrene introdusert her gi en måte å oppnå dette konsistens, og vil føre til resultater som lett kan sammenlignes på tvers av datasett. Selv om våre primære forskningsinteresser involvert undersøke endringer av genet expression og metabolitter, kunne fluene genereres også underkastes proteomikk eller epigenomic analyse. Proteomikk og epigenomic endringene som skjer i løpet av neurodegeneration er også sannsynlig å være av avgjørende betydning for sykdommen prosessen. Når det vitenskapelige samfunn slutt identifiserer hele spektret av molekylære endringer påvirker sykdommen prosessen, vil en sann systemnivå forståelse av sykdommen være mulig. På dette nivået, vil sykdomsmodifiserende behandling endelig fremstå som en realitet.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for Janice Santiago, Gabriel Figueroa, og Jose Herrera for teknisk bistand og Bloomington Drosophila Stock Center ved Indiana University for fly aksjer. DH og CW ble støttet av midler fra NSF-IOS-1051890. PF-F og LMM ble støttet av en salgsmulighet Seed Fund fra University of Florida.
Reagent | Company | Cat. Number | Comments |
Jazz mix Drosophila food | Fisher Scientific | AS-153 | |
Cryogenic Vials | Corning, Inc. | 430658 | |
Microtubes | Axygen | MCT-175-C-S | |
RNaseZap | Ambion | AM9786 | Treat all surfaces |
5/32″ grinding balls, stainless steel | OPS Diagnostics | GSS 156-5000-01 | |
TRIzol | Ambion | 15596018 | |
1-bromo-3-chloropropane | Sigma | B9673-200ML | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A416-500 | |
DEPC-treated water | Fisher Scientific | BP561-1 | |
DNase I | Promega | M6101 | |
RNasin ribonuclease inhibitor | Promega | N2111 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
Dynabeads mRNA Purification kit | Invitrogen | 610-06 | |
Conical Screw Cap Tubes | Fisher Scientific | 02-681-344 | |
Screw Caps w/O-Rings | Fisher Scientific | 02-681-364 | |
2.0 mm Zirconia beads | BioSpec Products | 11079124zx | |
Methanol, HPLC-grade | Fisher Scientific | A4524 | |
Chloroform, HPLC-grade | Acros organics | AC39076 | |
Drosophila Stocks | |||
da-Gal4 | Bloomington Stock Center | 5460 | |
Gal80[ts] | Bloomington Stock Center | 7108 | |
UAS-MJD-27Q | Bloomington Stock Center | 8149 | |
UAS-MJD-78Q | Bloomington Stock Center | 8150 | |
UAS-LacZ | Bloomington Stock Center | 8529 | |
Equipment | |||
Inject+Matic Sleeper | INJECT+MATIC | ||
Microsieve Set | Fisher Scientific | 3410531 | Use two largest meshes |
Geno/Grinder 2000 | SPEX Sample Prep | SP2100-115 | |
Sorvall Legend Microcentrifuge | ThermoScientific | 75002436 | |
FreeZone Plus 2.5 L Cascade Freeze Dry System | LabConco | 7670041 | |
BioAnalyzer v. 2.6 | Agilent | 2100 | |
DynaMag-2 Magnet | Invitrogen | 123-21D | |
NanoDrop spectrophotometer | ThermoScientific | ||
Fast Prep bead-beater | ThermoScientific | FP120 | |
Centrivap Vacufuge Plus | Labconco | 022820001 |