Separazione dei Ectoderma embrionali di topo viso e Mesenchima

Summary

Un protocollo per la separazione di ectoderma dell'embrione del viso e del mesenchima è descritto. Usiamo dispasi II per il trattamento di embrioni interi in primo luogo, analizzare interi protuberanze del viso, e poi separare il viso ectoderma e mesenchima.

Abstract

Schisi oro-facciali sono i difetti più frequenti cranio-facciali, che colpiscono 1,5 nel 1000 ^1,2 neonati in tutto il mondo. Palatoschisi orofacciale è causata da abnorme ³ Sviluppo del viso. In mouse e dell'essere umano, la crescita iniziale ed il modello del volto si basa su diversi piccoli boccioli di tessuto, le sporgenze del viso ^4,5. Il volto è derivato da sei coppie di protuberanze principali: i processi frontali nasali (FNP), protuberanze mascellari (MXP) e protuberanze mandibolari (MdP). Tali prominenze consistono rigonfiamenti di mesenchima che sono incassati in un epitelio sovrastante. Gli studi condotti su specie diverse hanno dimostrato che la segnalazione crosstalk tra ectoderma e mesenchima del viso è fondamentale per plasmare il volto ^6. Tuttavia, i dettagli meccanicistici riguardanti i geni coinvolti in questi relè di segnalazione sono carenti. Un modo per ottenere una comprensione globale di espressione genica, il fattore di trascrizione vincolante e marchi associati alla cromatina sviectoderma ping viso e mesenchima è quello di isolare e caratterizzare i compartimenti separati.

Qui vi presentiamo un metodo per separare ectoderma del viso e del mesenchima al giorno embrionale (E) 10.5, una fase critica dello sviluppo nella formazione del mouse facciale che precede la fusione delle protuberanze. Il nostro metodo è adattato da un approccio che abbiamo utilizzato in precedenza per sezionare protuberanze facciali ^7. In questo studio abbiamo utilizzato inbred C57BL / 6 topi come questo ceppo è diventato uno standard per la genetica, la genomica e la morfologia del viso ^8. Qui, tuttavia, sia per le quantità più limitata di tessuto disponibili, abbiamo utilizzato la outbred CD-1 ceppo che è conveniente per l'acquisto, più robusto per l'allevamento, e tende a produrre più embrioni (12-18) per cucciolata di qualsiasi inbred topo strain ^8. Dopo aver isolato embrione, neutro proteasi dispasi II è stato usato per trattare l'embrione intero. Poi, le protuberanze facciali sono stati sezionareed out, e l'ectoderma facciale è stato separato dal mesenchima. Questo metodo mantiene sia l'ectoderma e mesenchima viso intatto. I campioni cosi ottenuti possono essere utilizzati per le tecniche di rilevamento tra proteine, immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) assay, studi di microarray, e RNA-seq.

Protocol

1. Preparare dispasi II Preparare fresco Hepes-buffered saline (HBS) (50 mM Hepes / KOH pH 7,4, 150 mM NaCl). Aggiungere 2 ml di 0,5 M Hepes / KOH pH 7,4 e 1,2 ml 2.5 M NaCl in 16,8 ml ultrapura H 2 O. Rendere 10 mg / ml dispasi II. Pesare 0,2 g dispasi II (Roche, Cat # 4942078001) e sciogliere in 20 ml di HBS. Preparare 1,0 ml aliquote nelle singole provette Eppendorf e conservare a -20 ° C per la conservazione a lungo termine. Diluire 10 mg / ml dispasi II 1:10 in PBS prima d…

Representative Results

Dopo il trattamento dispasi II, l'ectoderma dell'embrione tende ad essere sciolto. Le protuberanze del viso dovrebbe essere intatto dopo la dissezione (Figura 2A). L'ectoderma isolato viso è chiara e priva di tessuto mesenchima (Figura 2B). Per determinare l'efficacia del protocollo e per rilevare la contaminazione incrociata abbiamo saggiato per proencefalo espresso ZIC3 9, ectodermica specifica CDH1 5 e mesenchimali specifica SOX10 10 …

Discussion

Questo protocollo fornisce un metodo semplice per separare ectoderma embrionale del mouse e mesenchima facciale sulla base di una prima fase di trattamento dispasi II. In studi precedenti, abbiamo svolto dissezione delle protuberanze del viso prima del trattamento dispasi II, ma abbiamo sempre trovato che il mesenchima diventa "appiccicoso" e più difficile da manipolare. Il nostro nuovo protocollo evita questo problema. Combinazione dispasi II trattamento con dolce forza fisica pipettando su e giù rende sepa…

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Dispase II (neutral protease, grade II)	Roche	4942078001	Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C .
RNAlater	Ambion	AM7021