Trennung von embryonalen Maus-Facial Ektoderm und Mesenchym

Summary

Ein Protokoll für die Trennung von Embryos Gesichts Ektoderm und Mesenchym beschrieben. Wir verwenden Dispase II ganzen Embryonen ersten Behandlung, sezieren gesamten Gesichtsbereich Protuberanzen aus, und trennen Sie dann den Gesichtsausdruck Ektoderm und Mesenchym.

Abstract

Orofazialen Spalten sind die häufigsten kraniofazialen Defekten, die 1,5 Einfluss von 1.000 Neugeborenen weltweit ^1,2. Orofazialen Spaltbildung durch abnorme Entwicklung des Gesichtes ³ ​​verursacht. Im menschlichen und Maus, anfängliche Wachstum und Strukturieren des Gesichts basiert auf mehreren kleinen Knospen von Gewebe, die Gesichtszüge Protuberanzen ^4,5. Gepaart frontal Nasenfortsätze (FNP), Kiefer Protuberanzen (MXP) und Unterkiefer Protuberanzen (MDP): Das Gesicht wird von sechs Protuberanzen abgeleitet. Diese Protuberanzen aus Schwellungen des Bindegewebes, die eingehüllt in eine darüberliegende Epithel sind. Studies in mehreren Arten haben gezeigt, dass Signalisierung Übersprechen zwischen Gesichts Ektoderm und Mesenchym ist entscheidend für die Gestaltung der Fläche ^6. Dennoch sind mechanistische Details hinsichtlich der Gene in diesen Melderelais beteiligt fehlen. Ein Weg, um ein umfassendes Verständnis der Genexpression zu gewinnen, Transkriptionsfaktorbindungsstellen und Chromatin Marken mit dem entwickelte assoziiertping Gesichts Ektoderm und Mesenchym ist zu isolieren und zu charakterisieren, die getrennten Gewebegruppen.

Hier stellen wir ein Verfahren zum Trennen Gesichts Ektoderm und Mesenchym am embryonalen Tag (E) 10.5, eine kritische Entwicklungsstadium in Maus Gesichts Formation, die Fusion der Protuberanzen vorausgeht. Unsere Methode wird aus dem Ansatz, den wir zuvor zum Präparieren Gesichts Protuberanzen ⁷ verwendet haben, angepasst. In dieser früheren Studie hatten wir Inzucht C57BL eingesetzt / 6 Mäusen als dieser Sorte hat sich zu einem Standard für Genetik, Genomik und Gesichtsmorphologie ^8. Hier jedoch aufgrund der beschränkten Mengen mehr von Gewebe vorhanden, haben wir die outbred CD-1-Stamm, der billiger ist erhältlich, robuster für Tierhaltung genutzt, und die dazu neigt, mehr Embryonen (12-18) pro Wurf als jede Inzuchtlinie produzieren Mausstamm ^8. Nach Embryos Isolierung wurde neutrale Protease Dispase II verwendet werden, um den gesamten Embryo zu behandeln. Dann wurden die Gesichts Protuberanzen sezierened aus, und die Gesichtszüge Ektoderm wurde aus dem Mesenchym getrennt. Diese Methode hält sowohl die Gesichts Ektoderm und Mesenchym intakt. Die Proben unter Verwendung dieser Methodik kann für Techniken einschließlich Protein-Erkennung, Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)-Assay, Microarray-Studien und RNA-seq verwendet werden.

Protocol

Ein. Planen Dispase II Ansetzen Hepes-gepufferter Kochsalzlösung (HBS) (50 mM Hepes / KOH, pH 7,4, 150 mM NaCl). 2 ml 0,5 M Hepes / KOH pH 7,4 und 1,2 ml 2,5 M NaCl in 16,8 ml Reinstwasser H 2 O. Machen Sie 10 mg / ml Dispase II. Wiegen 0,2 g Dispase II (Roche, Kat. Nr. 4942078001) und löst in 20 ml HBS. Bereiten Sie 1,0 ml Aliquots in einzelnen Eppendorf-Röhrchen und bei -20 ° C für die langfristige Lagerung. Verdünnte 10 mg / ml Dispase II 1:10 in PBS vor der Verwendung….

Representative Results

Nach Dispase II Behandlung, neigt das Ektoderm des Embryos locker zu sein. Die Gesichtszüge Protuberanzen sollte intakt sein nach der Sektion (Abbildung 2A). Die isolierte Gesichts Ektoderm ist klar und frei von Mesenchym Gewebe (Abbildung 2B). Um die Wirksamkeit des Protokolls zu bestimmen und um eine Kreuzkontamination wir getestet Vorderhirn detektieren ausgedrückt Zic3 9, ektodermalen spezifischen CDH1 5 und mesenchymalen spezifischen Sox10 10 mitt…

Discussion

Dieses Protokoll bietet eine einfache Methode, um embryonale Maus Gesichts Ektoderm und Mesenchym auf einer anfänglichen Dispase II Behandlungsschritt Basis zu trennen. In früheren Studien haben wir Dissektion der Gesichtsmuskeln Protuberanzen vor Dispase II Behandlung durchgeführt, aber wir haben immer wieder festgestellt, dass das Mesenchym "klebrig" und schwieriger zu manipulieren wird. Unser neues Protokoll vermeidet dieses Problem. Kombination Dispase II Behandlung mit sanfte körperliche Gewalt durch …

Materials

Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Dispase II (neutral protease, grade II)	Roche	4942078001	Make 10 mg/ml Dispase II stock solution in HBS. Aliquot and store at -20 °C .
RNAlater	Ambion	AM7021