Monitoraggio migrazione delle cellule dendritiche usando<sup> 19</sup> F /<sup> 1</sup> H Magnetic Resonance Imaging
Summary
Monitoraggio delle cellule utilizzando la risonanza magnetica ha guadagnato notevole attenzione negli ultimi anni. Questo protocollo descrive l'etichettatura delle cellule dendritiche con fluoro (<sup> 19</sup> Particelle F)-ricchi, l'applicazione in vivo di queste cellule, e monitorare l'entità della loro migrazione verso il linfonodo drenante con<sup> 19</sup> F /<sup> 1</sup> H MRI e<sup> 19</sup> F MRS.
Abstract
Progressi continui in modalità di imaging non invasive, come la risonanza magnetica (MRI) hanno notevolmente migliorato la nostra capacità di studiare i processi fisiologici o patologici negli organismi viventi. RM è anche dimostrando di essere un valido strumento per l'acquisizione di cellule trapiantate in vivo. Strategie di etichettatura iniziali di cellule per uso MRI fatta di agenti di contrasto che influenzano i tempi di rilassamento MR (T1, T2, T2 *) e portare ad un miglioramento (T1) o esaurimento (T2 *) del segnale in cui sono presenti cellule marcate. T2 * agenti di miglioramento come ultrasmall ferro agenti di ossido (USPIO) sono stati impiegati per studiare la migrazione delle cellule e alcuni sono stati anche approvato dalla FDA per l'applicazione clinica. Un inconveniente di T2 * agenti è la difficoltà di distinguere l'estinzione segnale creato dalle cellule marcate da altre risorse come coaguli di sangue, micro sanguinamenti o bolle d'aria. In questo articolo, descriviamo una tecnica emergente per le cellule di monitoraggio in vivo chesi basa sulla etichettatura delle cellule con fluoro (F 19) ricchi di particelle. Queste particelle sono preparate emulsionando perfluorocarburi (PFC) composti e poi utilizzata per etichettare le cellule, che successivamente può essere ripreso con 19 F MRI. Importanti vantaggi di PFC per il monitoraggio delle cellule in vivo includono (i) l'assenza di carbonio-bound 19 F in vivo, che poi produce immagini sfondo-free e completa delle cellule selectivityand (ii) la possibilità di quantificare il segnale della cella di 19 F spettroscopia MR .
Introduction
Il monitoraggio delle cellule in vivo è un aspetto cruciale in diversi campi della biomedicina. Per questo, le tecniche di imaging non invasive che possono localizzare selettivamente le cellule per un periodo di tempo sono estremamente preziose. Prima dello sviluppo di tridimensionale risonanza magnetica (MRI), il monitoraggio della migrazione delle cellule immunitarie stato limitato alle analisi microscopiche o biopsie tissutali. Monitoraggio delle cellule con l'aiuto della risonanza magnetica ha riscosso un enorme attenzione in questi ultimi anni, non solo per gli immunologi che studiano il comportamento delle cellule immunitarie in vivo, ma anche per i ricercatori clinici e di cellule staminali. Durante la metà degli anni '90, i primi studi sulle nanoparticelle di ossido di ferro 1 avviato una cascata di sviluppi per le celle di rilevamento con la risonanza magnetica. Particelle di ossido di ferro abbreviare il tempo di rilassamento MR (T2 *) delle cellule marcate e quindi causare deplezione segnale nelle immagini RM. Le particelle di ossido di ferro sono stati impiegati per i macrofagi etichetta 2, oligodendrociti progenitors 3 e molti altri tipi di cellule. Alcune di queste particelle sono anche stati clinicamente approvato dalla FDA per l'etichettatura di vaccini cellulari nei pazienti con melanoma 4. Dal momento che in vivo o l'etichettatura ex vivo di cellule con particelle di ossido di ferro si basa su una riduzione del segnale T2 * e quest'ultimo potrebbe essere portato anche su di suscettibilità in vivo relativi alla T2 * effetti come micro emorragie, depositi di ferro o bolle d'aria, potrebbe essere difficile identificare cellule marcate in vivo da altra sfondo T2 * estinzioni di segnale 5.
In questo articolo, si descrive una tecnica per il monitoraggio delle cellule dendritiche (DC) in vivo impiegando 19 F / 1 H risonanza magnetica (MRI). Questa tecnologia di tracciamento delle cellule è stato introdotto solo nel 2005 6, diversi anni dopo le prime applicazioni riconosciute per 19 F a risonanza magnetica sono stati riportati 7. Uno ADVA importantentage di 19 F su ferro ossido particella marcatura delle cellule è la bassa incidenza biologica di 19 F in tessuto, questo rende possibile l'individuazione celle molto selettivamente con immagini praticamente prive sfondo. Inoltre, è possibile sovrapporre il segnale MR 19 F dalle cellule marcate trapiantate con immagini anatomiche ottenute da convenzionale 1H RMN. F 19/1 H MRI è quindi considerevolmente rilevante per studi che studiano migrazione delle cellule in vivo. Le cellule studiate con questo metodo sono etichettati con 19 particelle F-ricchi. Perfluorocarburi sinteticamente-derivati (PFC) costituiti principalmente da carbonio e atomi di fluoro sono comunemente usati per preparare le particelle. Questi composti sono insolubili in acqua e devono essere emulsionato prima dell'applicazione in vitro o in vivo. La dimensione usuale delle particelle PFC che sono stati impiegati da altri gruppi per in vivo 19 esperimenti di monitoraggio F-MRIvaria tra 100 nm e 245 nm 6,8-10. Tuttavia abbiamo dimostrato che l'efficienza nella etichettatura cellule dendritiche con perfluoro-15-corona-5-etere (PFCE) particelle aumenta con l'aumentare delle dimensioni delle particelle (> 560 nm). 11
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo metodo di impiegare 19 F / 1 H MRI di seguire il movimento della CC nella linfonodo dà la possibilità di studiare i modelli di migrazione di cellule immunitarie in vivo. Le cellule dendritiche sono eccellenti esempi di rapida migrazione di cellule immunitarie che sono in grado di manovrare attraverso strutture tridimensionali senza strettamente aderire a substrati specifici 17. Sebbene la scarsa risoluzione spaziale (gamma micron) della tecnica descritta non è comparab…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft a SW (DFG WA 2804) e una borsa di studio universitaria a SW dal Centro di Ricerca Sperimentale e Clinica, una collaborazione del Centro Max Delbrück per la medicina molecolare e la Facoltà di Medicina Charité di Berlino. I finanziatori non aveva alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare o preparazione del manoscritto. Ringraziamo il Sig. Robert Westphal per il supporto tecnico durante il suo stage presso il nostro laboratorio.
Materials
| REAGENTS | |||
| C57BL/6 mice | Charles River, Berlin | ||
| RPMI | Gibco | 21875-091 | |
| FBS Superior | Biochrom AG | S 0615 | |
| HEPES | Gibco-Invitrogen | 15630-056 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030-024 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| PFA | Santa Cruz | sc-281692 | |
| Perfluoro-15-crown-5-ether | ChemPur | 391-1996 | |
| Pluronic F-68 | Sigma Aldrich | P5556 | |
| Petri dishes (35 x 10 mm) | VWR, Germany | 391-1996 | |
| 27 ½ G syringes | VWR, Germany | 612-0151 | |
| Nylon cell strainers (100 μm mesh) | VWR, Germany | 734-0004 | |
| NMR tubes | VWR, Germany | 634-0461 | |
| EQUIPMENT | |||
| Dissection tools | FST | ||
| CO2 incubator | Binder | ||
| Small animal MR system | Bruker Biospin | 9.4T BioSpec 94/20 USR, ParaVision Acquisition and Processing Software | |
| 1H/19F dual-tunable volume RF coil | Rapid Biomed, Würzburg, Germany | 35 mm inner diameter, 50 mm length | |
| 19F spectroscopy coil | in-house | tune/match loop coil, 4 turns, inner diameter 5 mm, 10 mm long, two capacitors for tuning and matching | |
| Isoflurane inhalation system | Föhr Medical Instruments GmbH | ||
| Animal monitoring system Model 1025 | SA Instruments Inc., New York, USA |
Riferimenti
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