本视频演示了用来种植原代培养的胚胎的程序<em>爪蟾</em>神经和肌肉细胞和该制剂的同时前和突触后的膜片钳记录的用处。
已取得的无脊椎动物的准备工作,最显着的鱿鱼巨大的突触的突触前神经递质释放的离子电流的耦合多的信息。然而,除了用于制备这里描述的,存在几脊椎动物制剂,它能够使神经递质释放和突触前的离子电流的同时测量。胚胎爪蟾运动神经元和肌肉细胞中,可以在简单的培养基在室温下一起成长,它们将形成功能性突触在1224小时内,并且可以被用来研究数天的神经和肌肉细胞的发育和突触的相互作用(直到过度生长)。这些共培养超过其他脊椎动物制剂的一些优点包括简单的准备,保持文化和在室温下工作的能力,和突触形成2就绪无障碍-4。制品被广泛地用于研究的生物物理特性的离子通道及突触前递质释放的调节5-8。此外,准备借给其他用途,包括研究神经轴突生长和突触9-12,神经递质的释放13日至15日 ,在神经调节16,17扩散使者的作用的分子机制,并在体外突触可塑性18 – 19。
成功的运动神经元和肌肉细胞共培养的关键步骤是使用适当的上演了从非洲爪蛙的人工繁殖胚胎的未分化脊柱神经细胞和成肌细胞,并仔细无菌解剖。受精卵应保持原状,直到他们达到约10级左右移动他们更快停止他们的发展。健康的胚胎,确定一个平滑的外观和棕色和白色斑驳的色素。第一阶段22日至24日的胚胎是最有用的,因为这是点后神经管闭合之前,在开发过程中的心肌细胞已分化显着。此外,从旧的胚胎细胞未能,在CMF分离。护理时,应采取删除,因为它牢固地粘附在胚胎的卵黄膜。被撕裂膜应使用锋利的镊子,使胚胎出现完整的。另一个重要的precaution是小心地将细胞在培养皿的底部(而不是让他们在那里定居)。这是首选方法,因为这增加的可能性,这些细胞将坚持培养皿中。
功能神经传导神经和肌肉之间可以就在突触后记录,并常可观察自发神经支配肌肉收缩后确定。联合国神经支配的肌肉细胞的不抽搐文化的。突触后记录单是有用的小终板电流或电位,但诱发发布的测量需要突触前和突触后电流的刺激,以及相关的需要双膜片钳记录。
这里描述的除了配对补丁的记录方法,该制剂提供了机会,介绍第三吸管在神经元的胞 体5,这使得动作电位的产生THAt可以传播到突触前的静脉曲张,导致神经递质的释放。此外,假定,被认为是介导或调节突触传递的代理可以被引入到两侧的突触:通过肌肉细胞移液管或通过扩散从三分之一的移液管,放置在苏摩。
The authors have nothing to disclose.
由美国国家科学基金会(0854551)资助。
Equipment/Supplies | Vendor | Catalogue/Model Number | |||||||||||||||
Insulin-Transferrin-Selenium | Sigma | I1884 | |||||||||||||||
Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG-10 | |||||||||||||||
Vapor Pressure Osmometer | Wescor | 5100C | |||||||||||||||
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |||||||||||||||
Amphotericin B | Sigma | A4888 | |||||||||||||||
Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |||||||||||||||
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Table 1.