Denne video viser de procedurer, der anvendes til at vokse primære kulturer af embryonale<em> Xenopus</em> Nerve-og muskelceller og nytten af dette præparat til fremstilling af samtidige præ-og post-synaptisk patch clamp optagelser.
Mange oplysninger om koblingen af præsynaptiske ionstrømme med frigivelsen af neurotransmitter er blevet opnået fra hvirvelløse præparater, især blæksprutte gigant synapse 1. Men bortset fra den, der er beskrevet her, få vertebrate præparater findes i hvilket det er muligt at foretage samtidige målinger af neurotransmitterfrigivelse og præsynaptiske ionstrømme. Embryoniske Xenopus motoneuroner og muskelceller kan dyrkes sammen på simpel dyrkningsmedium ved stuetemperatur, vil de danne funktionelle synapser inden for 12 til 24 timer, og kan anvendes til undersøgelse af nerve-og muskel celleudvikling og synaptiske interaktioner i flere dage (indtil tilgroning forekommer). Nogle af fordelene ved disse co-kulturer flere andre hvirveldyr præparater omfatter enkelhed fremstillingen, evnen til at opretholde kulturerne og arbejde ved stuetemperatur, og den lette adgang af synapserne dannede 2-4. Præparatet er blevet brugt i vid udstrækning til at studere de biofysiske egenskaber af præsynaptiske ionkanaler og regulering af transmitterfrigivelse 5-8. Endvidere er præparatet egnet sig til andre formål, herunder undersøgelse af neuritudvækst og synaptogenesen 9-12, molekylære mekanismer i neurotransmitterfrigivelse 13-15, hvilken rolle diffunderbare budbringere i neuromodulation 16,17, og di vitro-synaptisk plasticitet 18 – 19.
Vigtige skridt i den vellykkede co-dyrkning af motoneuroner og muskelceller er anvendelse af passende iscenesat embryoner produceret fra den inducerede opdræt af Xenopus frøer, og den omhyggelige aseptisk dissektion af de udifferentierede neuroner i rygmarven og myoblaster. Befrugtede æg bør overlades uforstyrret, indtil de tilnærmelsesvis nå fase 10 eller så som at flytte dem før ofte standser deres udvikling. Sunde fostre er identificeret ved et glat udseende og en brun og hvid meleret farve. Stage 22-24 embryoer er de mest nyttige, fordi dette er det punkt i udviklingen lige efter de neurale rør lukket og før myocytterne er differentieret betydeligt. Desuden undlader celler fra ældre fostre at dissociere godt i CMF. Der bør udvises omhu ved fjernelse af ægmembran som det klæber stærkt til embryoet. Membranen skal rives fra hinanden ved hjælp af skarpe tang, således at embryonet opstår intakt. Et andet vigtigt precaution er omhyggeligt at placere celler på bunden af dyrkningsskålen (i stedet for at lade dem slå sig ned). Denne fremgangsmåde foretrækkes, da dette forøger sandsynligheden for, at cellerne vil klæbe til dyrkningsskålen.
Funktionel neurotransmission mellem nerve og muskel kan bestemmes med blot postsynaptisk optagelse og ofte kan konstateres ved observation af spontan muskel sammentrækning efter innervation. Un-innerverede muskelceller ikke spjæt i kultur. Postsynaptiske optagelse alene er nyttig til optagelse miniature endepladen strømme eller potentialer, men målinger af fremkaldte frigivelse kræver præsynaptiske stimulering, og korrelation af præ-og postsynaptiske strømme kræver dobbelt patch-clamp.
Udover parret-patch optagelse beskrevet her, tilbyder dette præparat mulighed for at indføre en tredje pipette på den neuronale soma 5 Dette tillader generation af en handling potentiale that kan forplante sig til den præsynaptiske varicosity og føre til frigivelsen af neurotransmitter. Desuden kan putative midler, der menes at mediere eller modulere synaptisk transmission indføres til hver side af synapsen: via muskelceller pipette eller ved diffusion fra en tredje pipette anbragt på soma.
The authors have nothing to disclose.
Finansieret af NSF (0.854.551).
Equipment/Supplies | Vendor | Catalogue/Model Number | |||||||||||||||
Insulin-Transferrin-Selenium | Sigma | I1884 | |||||||||||||||
Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG-10 | |||||||||||||||
Vapor Pressure Osmometer | Wescor | 5100C | |||||||||||||||
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |||||||||||||||
Amphotericin B | Sigma | A4888 | |||||||||||||||
Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |||||||||||||||
|
Table 1.