이 동영상은 배아의 주 문화를 성장하는 데 사용되는 절차를 설명합니다<em> Xenopus</em> 신경과 근육 세포와 동시 사전 및 사후 신경 패치 클램프 녹음을 만들기위한이 준비 유용성.
신경 전달 물질의 방출과 presynaptic 이온 전류의 커플 링에 대한 많은 정보는 특히 invertebrate 준비, 오징어 거대한 시냅스 1 일부터 취득했습니다. 그러나, 준비를 제외하고 여기에 설명 된, 몇 가지 척추의 준비는 신경 전달 물질 자료와 presynaptic 이온 전류의 동시 측정을 할 수 있습니다있는 존재합니다. (때까지 12-24시간 내에 기능 시냅스를 형성하고, 며칠 동안 신경과 근육 세포 개발과 신경의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수있는, 배아 Xenopus의 motoneurons와 근육 세포는 실온에서 간단한 문화 매체에서 함께 성장하실 수 있습니다 전면에 자라 난)가 발생합니다. 다른 척추 동물의 준비 이상이 공동 문화의 장점은 준비의 단순함, 상온에서 문화와 작업을 유지 할 수있는 능력, 2를 형성 시냅스의 준비 접근성을 포함-4. 준비는 presynaptic 이온 채널과 송신기 릴리스 5-8의 규정에의 biophysical 속성을 공부하고 널리 사용되었습니다. 또한, 준비는 9-12 neurite 가지와 synaptogenesis 연구, 신경 전달 물질 릴리스 13-15, neuromodulation 16,17의 diffusible 메신저의 역할의 분자 메커니즘, 그리고 체외 신경 소성 18 등 다른 용도로 자신을 빌려하고 있습니다 – 19.
motoneurons 및 근육 세포의 성공적인 공동 배양의 주요 단계를 적절하게 Xenopus 개구리 유도 사육에서 생산 배아를 조작의 사용 및 undifferentiated 척추 뉴런과 myoblasts의주의 무균 해부 있습니다. 빨리 자주 개발을 halts 이동로가 약 정도 (10) 개최에 도달 할 때까지 수정 된 달걀은 그대로 남아있을 것입니다. 건강한 태아는 부드러운 모양과 갈색과 흰색 얼룩덜룩 한 색소에 의해 식별됩니다. 이 근세포가 크게 차별화 한 단지 신경 튜브 닫히면 후에 전에 개발 중에 지점이기 때문에 스테이지 22-24 태아가 가장 유용합니다. 또한, 이전 배아의 세포는 CMF에 잘 해리하지. 그 배에 강력하게 준수로 vitelline 막 제거 할 때주의가 필요합니다. 배아는 그대로 나옵니다 있도록 막은 날카로운 집게를 사용하여 해체해야합니다. 또 다른 중요한 precaution은 배양 접시 (오히려이 정착 두는 것보다)의 하단에 세포를주의 깊게을 배치하는 것입니다. 이 세포가 배양 접시를 준수 될 확률이 높아집니다으로이 방법을 사용하는 것이 좋습니다.
신경과 근육 사이의 기능 neurotransmission 단 postsynaptic 기록으로 결정 할 수 있으며, 자주 innervation 후 자발적인 근육 수축의 관찰에 의해 ascertained 수 있습니다. 취소 innervated 근육 세포는 문화에 경련하지 않습니다. 혼자 Postsynaptic 녹음이 미니어처 endplate 전류 또는 전위하지만 evoked 출시 측정 사전 및 postsynaptic 전류 presynaptic 자극, 그리고 상관 관계 패치 – 클램프 더블을 필요로 필요를 기록하는 데 유용합니다.
여기에 설명 된 페어 – 패치 녹화 방법 외에,이 준비는이 수있는 neuronal 소마 5 삼분의 일 피펫을 소개 할 수있는 기회를 제공하는 행위 가능성이 THA의 생성t는 presynaptic varicosity에 전파하고 신경 전달 물질의 방출을 유도 할 수 있습니다. 또한, 중재 할 생각이 신경 전달을 조절 아르 putative 대리인은 시냅스의 양쪽에 도입 될 수있다 : 근육 세포 피펫을 통해 또는 소마에 배치 삼분의 일 피펫의 확산을 통해.
The authors have nothing to disclose.
NSF (0,854,551)에 의해 기금을 마련했습니다.
Equipment/Supplies | Vendor | Catalogue/Model Number | |||||||||||||||
Insulin-Transferrin-Selenium | Sigma | I1884 | |||||||||||||||
Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG-10 | |||||||||||||||
Vapor Pressure Osmometer | Wescor | 5100C | |||||||||||||||
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |||||||||||||||
Amphotericin B | Sigma | A4888 | |||||||||||||||
Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |||||||||||||||
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Table 1.