Denne videoen demonstrerer Fremgangsmåtene anvendt til vokse primære kulturer av embryonale<em> Xenopus</em> Nerve og muskelceller og nytten av dette preparatet for å lage samtidige pre-og postsynaptiske patch clamp opptak.
Mye informasjon om koblingen av presynaptiske ioniske strømmer med utgivelsen av nevrotransmitter er innhentet fra virvelløse preparater, særlig blekksprut gigantiske synapse en. Imidlertid, bortsett fra for fremstilling som er beskrevet her, er det få virveldyr preparater eksisterer der det er mulig å foreta samtidige målinger av neurotransmitterfrigjørelse og presynaptisk ioniske strømninger. Embryoniske Xenopus motoneurons og muskelceller kan dyrkes sammen i enkel kultur medium ved romtemperatur, de vil danne funksjonelle synapser innen 12-24 timer, og kan brukes til å studere nerve og muskel celle utvikling og synaptiske interaksjoner i flere dager (inntil overvekst forekommer). Noen fordeler disse co-kulturer over andre virveldyr preparater omfatter enkelhet av forberedelse, muligheten til å opprettholde de kulturer og arbeid ved romtemperatur, og den klare tilgjengeligheten synapsene dannet 2-4. Preparatet har blitt brukt mye til å studere biofysiske egenskaper presynaptiske ionekanaler og regulering av senderen utgivelse 5-8. I tillegg har forberedelse lånes seg til andre bruksområder, inkludert studier av neurite utvekst og synaptogenesis 9-12, molekylære mekanismer av nevrotransmitter 13-15 utgivelse, rollen diffusjonsevne budbringere i neuromodulation 16,17, og in vitro synaptisk plastisitet 18 – 19.
Avgjørende trinn i vellykkede co-dyrkning av motoneurons og muskelceller er bruk av hensiktsmessig iscenesatte embryoene produsert fra den induserte avl av Xenopus frosker, og forsiktig aseptisk disseksjon av de udifferensierte spinal nevroner og myoblaster. Befruktede egg bør overlates uforstyrret helt til de når omtrent scenen 10 eller så som å flytte dem før ofte stopper deres utvikling. Friske fostre blir identifisert av en glatt utseende og en brun og hvit spettet farge. Stage 22-24 fostre er mest nyttig fordi dette er det punktet under utvikling like etter nevralrøret lukkes og før myocytes har differensiert betydelig. I tillegg, celler fra eldre embryoer mislykkes å dissosiere godt i CMF. Forsiktighet bør tas når du fjerner vitelline membran som det fester seg sterkt til embryoet. Membranen skal rives i stykker med skarpe tang slik at embryoet kommer intakt. En annen viktig precaution er å nøye plassere cellene på bunnen av kulturen parabolen (heller enn å la dem avgjøre det). Denne metoden er foretrukket som dette øker sannsynligheten for at cellene skal følge den kulturen parabolen.
Funksjonell nevrotransmisjon mellom nerve og muskel kan avgjøres med bare postsynaptiske opptak og ofte kan fastslås ved observasjon av spontane muskel sammentrekning etter innervasjon. Un-innerverte muskelceller ikke nappe i kultur. Postsynaptiske opptak alene er nyttig for innspilling miniatyr gavl strøm eller potensial, men målinger av fremkalt utgivelsen krever presynaptisk stimulering, og korrelasjon av pre-og postsynaptiske strømmer krever dobbel patch-clamp.
Foruten parvise patch opptak som beskrives her, tilbyr dette preparatet muligheten til å presentere en tredjedel pipette på neuronal soma 5 Dette gjør at generasjonen av et aksjonspotensial that kan overføres til den presynaptiske åreknute og føre til frigjøring av nevrotransmitter. I tillegg kan putative agenter som er tenkt å mediere eller modulere synaptisk transmisjon bli introdusert til hver side av synapsen: via muskelcelle pipette eller via diffusjon fra en tredje pipette plassert på soma.
The authors have nothing to disclose.
Finansiert av NSF (0.854.551).
Equipment/Supplies | Vendor | Catalogue/Model Number | |||||||||||||||
Insulin-Transferrin-Selenium | Sigma | I1884 | |||||||||||||||
Human Chorionic Gonadotropin | Sigma | CG-10 | |||||||||||||||
Vapor Pressure Osmometer | Wescor | 5100C | |||||||||||||||
Minutien Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |||||||||||||||
Amphotericin B | Sigma | A4888 | |||||||||||||||
Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |||||||||||||||
|
Table 1.