Mesure du pH vacuolaire et cytosolique<em> In Vivo</em> En cellule de levure Suspensions
Summary
PH vacuolaire et cytosolique peut être mesurée en levures vivantes (<em> S. cerevisiae</em>) Cellules en utilisant des colorants fluorescents ratiométriques localisés dans des compartiments cellulaires spécifiques. Nous décrivons les procédures pour mesurer le pH vacuolaire avec BCECF-AM, qui se localise dans la vacuole de la levure, et le pH cytosolique avec une GFP sensible au pH quotientométrique cytosolique (levure pHluorin).
Abstract
Vacuolar et pH cytosolique sont très réglementés dans les cellules de levure et d'occuper un rôle central dans l'homéostasie globale du pH. Nous décrivons les protocoles de mesure radiométrique de pH in vivo en utilisant des fluorophores sensibles au pH localisés dans la vacuole ou cytosol. PH vacuolaire est mesurée en utilisant BCECF, qui se localise dans la vacuole dans la levure lors de son introduction dans les cellules, sous sa forme d'ester d'acétoxyméthyle. PH cytosolique est mesuré avec une GFP sensible au pH exprimé sous le contrôle d'un promoteur de levure, la levure pHluorin. Les méthodes de mesure des ratios de fluorescence dans des suspensions de cellules de levure dans un fluorimètre sont décrits. Grâce à ces protocoles, des mesures ponctuelles de temps simples de pH dans des conditions différentes ou dans différents mutants de levure ont été comparées et les variations de pH au cours du temps ont été surveillés. Ces méthodes ont également été adaptés au format du lecteur de plaque à fluorescence pour des expériences à haut débit. Avantages de mesures de pH ratiométriques par rapport aux autres apapproches en cours d'utilisation, les problèmes potentiels et les solutions expérimentales, et les perspectives pour le futur usage de ces techniques sont également décrites.
Introduction
homéostasie du pH est un processus dynamique et très réglementé dans tous les organismes 1,2. Processus biochimiques sont strictement réglementées par le pH et les environnements intracellulaires sont accordés sur des gammes de pH étroite pour permettre une activité optimale des enzymes résidentes. Cependant, l'homéostasie du pH intracellulaire peut être contestée par des changements rapides dans l'environnement pH, les changements métaboliques et certaines voies de signalisation. En outre, le pH intracellulaire peut se servir comme un signal important. Enfin, de nombreux organites maintenir des valeurs de pH luminales qui sont distincts du cytosol environnante et indispensable au bon fonctionnement des organites spécifiques.
Saccharomyces cerevisiae actions d'un certain nombre de mécanismes d'homéostasie du pH avec eucaryotes supérieurs 2. Dans les organites acides de la voie d'endocytose / lysosomale, le pH est principalement contrôlée par l'ATPase vacuolaire translocation de protons hautement conservée (V-ATPase), agissant de concert avec de nombreux échangers dépendant du gradient de pH. Toutes les cellules eucaryotes ont aussi des mécanismes d'exportation de protons. Chez les champignons et les plantes, une seconde, la pompe à protons distinct à la membrane plasmique, PMA1, les exportations protons métaboliques et l'on croit être le déterminant majeur de pH cytosolique et du potentiel de membrane plasmique. La flexibilité génétique de S. cerevisiae et son importance commerciale, en ont fait un modèle très intéressant et important pour l'étude de l'homéostasie du pH 2.
En plus d'être les principaux moteurs de organite acidification, V-ATPase sont très réglementés et enzymes de notre laboratoire s'intéresse aux mécanismes de régulation V-ATPase comprendre. Pour atteindre cet objectif, nous avons eu recours à des mesures de pH in vivo de pH vacuolaire et cytosolique: 1) suivre les réponses à l'évolution des conditions extracellulaires, comme la privation de glucose et readdition, 2) d'examiner les effets des mutations qui compromettent l'activité V-ATPase, et 3) d'explorer la coornation des organelles et la membrane plasmique pompes à protons 3-5. Ces expériences ne sont devenus possibles grâce à l'élaboration d'indicateurs de pH ratiométriques robustes qui se prêtent à utiliser dans les cellules de levure. . Plant et al ont d'abord montré que BCECF (2'7'-bis-(2-carboxyéthyl) -5 – (et 6)-carboxyfluorescéine), qui a été largement utilisé pour mesurer le pH cytosolique dans les cellules de mammifères, s'accumule dans la vacuole de la levure au lieu de le cytosol 6. Cette différence de BCECF localisation a été attribué aux nombreuses enzymes hydrolytiques dans la vacuole, qui sont susceptibles responsable du clivage de l'ester méthylique de BCECF acétoxy-AM (ester acétoxyméthylique de BCECF) et vacuolaire rétention 6. Ali et al. 7 développées mesure du pH vacuolaire utilisant BCECF et adapté ces mesures à un format de lecteur de plaques à fluorescence. Brett et al. Introduit pHluorin de levure en tant que moyen de mesure du pH cytosolique dans la levure par l'expression d'un r plasmidiqueatiometric GFP sensible au pH 8 sous le contrôle d'un promoteur spécifique de levure 9.
Les spectres d'excitation des deux BCECF et la levure pHluorin sont sensibles au pH, si elles sont utilisées comme indicateurs de pH ratiométriques dans lequel le rapport de fluorescence à deux longueurs d'onde d'excitation, mesurée à une longueur d'onde d'émission, fournit une mesure de pH 8,10. Ces levures capteurs de pH vacuolaire et cytosolique ont été utilisées pour les deux mesures unicellulaires et basée sur la population. Mesures monocellulaires 6,11 sont réalisées par microscopie à fluorescence et une analyse d'image. Fluorescence vacuolaire ou cytosolique à deux longueurs d'onde est mesurée pour chaque cellule. Les mesures basées sur la population sont réalisées soit dans un lecteur de microplaques avec des capacités de fluorescence appropriés ou dans un fluorimètre. Nous avons généralement fait nos mesures dans un fluorimètre, car il permet un accès facile pour l'ajout d'éléments tels que le glucose au cours de conmesures cinétiques continue. Nos protocoles de laboratoire courants pour la mesure du pH vacuolaire et cytosolique sont énumérés ci-dessous, les deux sont également facilement adapté aux essais en microplaques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous avons utilisé ces protocoles pour répondre à un certain nombre d'aspects de l'homéostasie du pH. Par exemple, nous avons comparé les réponses cytosolique et le pH des cellules mutantes et de type sauvage V-ATPase déficient 4,5. Nous avons également examiné les effets des conditions de croissance modifiées, le pH extracellulaire, en particulier sur la réponse du pH vacuolaire de glucose 3. Surtout, les réponses que nous observons sont cohérents avec d'autres méthodes d…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le NIH R01 GM50322 à PM Kane. Les auteurs remercient le Dr Rajini Rao, de l'Université Johns Hopkins de fournir les levures pHluorin plasmides et des conseils sur les mesures de pH ratiométriques, et le Dr Gloria A. Martinez Munoz pour travailler sur ces protocoles pour notre laboratoire.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
Riferimenti
- Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
- Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
- Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
- Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
- Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
- Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
- Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
- Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5′(and 6′)-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1′(3’H)-isobenzofuran]-3′-one and 2′,7′-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
- Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
- Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
- Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
- Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
- Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
- Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).
- Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619 (2011).
- Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
- Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
- Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).
