Messung von pH Vacuolar und Cytosolic<em> In Vivo</em> In Hefe Zellsuspensionen
Summary
Vacuolar und cytosolischen pH-Wert kann in lebende Hefe gemessen werden (<em> S. cerevisiae</em>)-Zellen unter Verwendung ratiometrische Fluoreszenzfarbstoffe lokalisiert spezifischen zellulären Kompartimenten. Wir beschreiben Methoden zur Messung des pH-Wertes mit Vakuolen BCECF-AM, die der Vakuole lokalisiert in Hefe und cytosolischen pH mit einer zytosolischen ratiometrische pH-sensitive GFP (Hefe pHluorin).
Abstract
Vacuolar und cytosolischen pH sind hoch in Hefezellen reguliert und nehmen eine zentrale Rolle in der Gesamtstrategie pH-Homöostase. Wir beschreiben Protokolle für ratiometrischen Messung von pH in vivo mit pH-sensitiven Fluorophoren lokalisiert zur Vakuole oder Cytosol. Vacuolar pH wird unter Verwendung BCECF, die in der Vakuole lokalisiert, wenn sie in Hefe-Zellen in ihrer Acetoxymethylester Form eingeführt. Cytosolischen pH-Wert mit einem pH-sensitive GFP unter Kontrolle eines Hefe-Promotors, Hefe pHluorin ausgedrückt gemessen. Verfahren zur Messung der Fluoreszenz-Verhältnisse in Hefe Zellsuspensionen in einem Fluorimeter beschrieben. Durch diese Protokolle haben einzigen Zeitpunkt Messungen des pH unter verschiedenen Bedingungen oder in verschiedenen Hefe-Mutanten verglichen und Veränderungen im pH im Laufe der Zeit wurden überwacht. Diese Methoden haben auch zu einem Fluoreszenz-Reader-Format für High-Throughput-Experimente angepasst. Vorteile von ratiometrischen pH-Messungen im Vergleich zu anderen apAnsätze derzeit im Einsatz, mögliche experimentelle Probleme und Lösungen und Perspektiven für die zukünftige Verwendung dieser Techniken werden ebenfalls beschrieben.
Introduction
pH-Homöostase ist ein dynamisches und stark regulierten Prozess in allen Organismen 1,2. Biochemische Prozesse sind eng durch pH-reguliert und intrazellulären Umgebungen zu engen pH-Bereich abgestimmt, um eine optimale Wirkung der Enzyme Bewohner zu ermöglichen. Allerdings kann intrazelluläre pH-Homöostase durch schnelle Änderungen der Umweltbedingungen pH-, Stoffwechsel-Verschiebungen und bestimmte Signalwege angefochten werden. Darüber hinaus können intrazelluläre pH selbst als ein wichtiges Signal dienen. Schließlich führen viele Organellen luminalen pH-Werten, die sich von der umgebenden Cytosol und wichtig für organellspezifisch Funktionen sind.
Die Hefe Saccharomyces cerevisiae Aktien eine Reihe von pH-Homöostase Mechanismen mit höheren Eukaryoten 2. In den sauren Organellen der endozytischen / lysosomalen Weg wird vor allem durch den pH-Wert hoch konserviert vacuolar Protonen-Translokation ATPase (V-ATPase) gesteuert wird, in Abstimmung mit den vielen exchangers abhängig vom pH-Gradienten. Alle eukaryotischen Zellen haben auch Protonen-Export-Mechanismen. In Pilzen und Pflanzen, eine zweite, deutlich Protonenpumpenhemmer an der Plasmamembran, PMA1 Exporte metabolische Protonen und ist vermutlich die wichtigste Determinante der cytosolischen pH-und Plasma-Membran Potenzial. Die genetische Flexibilität S. cerevisiae und seine wirtschaftliche Bedeutung, haben es ein sehr interessantes und wichtiges Modell für die Untersuchung pH 2 Homöostase.
Abgesehen davon, dass die primären Treiber der Organellen Versauerung, sind V-ATPasen hoch Enzyme reguliert und wird in unserem Labor zu verstehen Mechanismen der V-ATPase Regulierung interessiert. Mit diesem Ziel haben wir in vivo Messungen von pH Vakuole und cytosolischen pH wurde mit: 1), um Antworten auf veränderte extrazelluläre Bedingungen, wie Glukose Deprivation und Neuansatz, 2) zu überwachen, um die Auswirkungen von Mutationen, dass ein Kompromiss V-ATPase-Aktivität zu untersuchen, und 3) zur Erkundung der Koorrung der Organellen und Plasmamembran Protonenpumpen 3-5. Diese Experimente wurden erst durch die Entwicklung von robusten ratiometrischen pH-Indikatoren zugänglich in Hefezellen nutzen möglich. . Pflanze et al zeigten erstmals, dass BCECF (2'7'-Bis-(2-Carboxyethyl) -5 – (und 6)-Carboxyfluorescein), das verwendet wurde, weitgehend auf cytosolischen pH in Säugetierzellen zu messen, in der Hefe Vakuole akkumuliert anstatt das Cytosol 6. Dieser Unterschied in der BCECF Lokalisierung hat der vielen hydrolytischen Enzymen in die Vakuole, die geeignet sind, die für die Spaltung der Acetoxy-Methylester aus BCECF-AM (Acetoxymethylester BCECF) und Vakuolen Retention 6 zurückgeführt. Ali et al. 7 weiterentwickelt vacuolar pH-Messung mit BCECF und angepasst diese Messungen mit einem Fluoreszenz-Reader Format. Brett et al. Eingeführt Hefe pHluorin als Mittel zur Messung der cytosolischen pH in Hefe durch Expression einer Plasmid-borne ratiometric pH-sensitive GFP 8 unter der Kontrolle eines Hefe-Promotors 9.
Die Anregungsspektren sowohl BCECF und Hefe pHluorin sind pH-empfindlich, so dass sie als ratiometrische pH-Indikatoren, wobei das Verhältnis der Fluoreszenz bei zwei Anregungswellenlängen, in einer einzigen Emissionswellenlänge gemessen, ein Maß von pH 8,10 verwendet. Diese Hefe Vakuole und cytosolischen pH-Sensoren sind sowohl für Single-Cell-und bevölkerungsbezogenen Messungen verwendet worden. Einzel-Zell-Messungen 6,11 werden durch Fluoreszenz-Mikroskopie und Bildanalyse durchgeführt. Vacuolar oder cytosolische Fluoreszenz bei den beiden Wellenlängen für jede Zelle gemessen. Die Bevölkerung-basierten Messungen werden entweder in einem Mikroplatten-Reader mit entsprechenden Fluoreszenz-Funktionen oder in einem Fluorimeter durchgeführt. Wir haben unsere Messungen im Allgemeinen in einem Fluorimeter durchgeführt, weil sie einen einfachen Zugang für die Zugabe von Komponenten, wie Glucose während con bietetkontinuierlichen kinetischen Messungen. Unsere aktuellen Labor-Protokolle für die Messung der Vakuole und cytosolischen pH sind unten aufgeführt, beide sind auch leicht zu Mikrotiterplatten-Assays angepasst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben diese Protokolle verwendet, um eine Reihe von Aspekten der pH-Homöostase adressieren. Zum Beispiel haben wir cytosolischen pH und Antworten von Wildtyp-und V-ATPase-defizienten mutierten Zellen 4,5 verglichen. Wir haben auch die Auswirkungen von Veränderungen der Wachstumsbedingungen, insbesondere extrazellulären pH auf pH vacuolar Reaktion auf Glukose 3 untersucht. Wichtig ist, dass die Antworten, die wir beobachten, sowohl im Einklang mit anderen Methoden der quantitativen pH-Messung…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch NIH R01 GM50322, um PM Kane unterstützt. Die Autoren danken Dr. Rajini Rao, Johns Hopkins University für die Bereitstellung der Hefe-pHluorin Plasmiden und für Erfahrungsberichte zu ratiometrische pH-Messungen, und Dr. Gloria A. Martinez Munoz für das Arbeiten out diese Protokolle für unsere lab.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
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