Vacuolar और साइटोसोलिक पीएच का मापन<em> Vivo में</em> खमीर सेल निलंबन में
Summary
Vacuolar और साइटोसोलिक पीएच रहते खमीर में मापा जा सकता है (<em> एस cerevisiae</em>) विशिष्ट सेलुलर डिब्बों के लिए स्थानीय ratiometric फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग कोशिकाओं. हम खमीर में रिक्तिका लिए localizes जो BCECF-हूँ, और एक साइटोसोलिक ratiometric पीएच संवेदनशील GFP (खमीर pHluorin) के साथ साइटोसोलिक पीएच साथ vacuolar पीएच मापने के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन है.
Abstract
Vacuolar और पीएच साइटोसोलिक अत्यधिक खमीर कोशिकाओं में विनियमित और समग्र पीएच homeostasis में एक केंद्रीय भूमिका पर कब्जा कर रहे हैं. हम कोटर या साइटोसॉल के लिए स्थानीय पीएच के प्रति संवेदनशील fluorophores का उपयोग vivo में पीएच की ratiometric माप के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन है. Vacuolar पीएच अपने acetoxymethyl एस्टर रूप में कोशिकाओं में शुरू की जब खमीर में रिक्तिका लिए localizes जो BCECF, का उपयोग कर मापा जाता है. साइटोसोलिक पीएच एक खमीर प्रमोटर, खमीर pHluorin के नियंत्रण में व्यक्त एक पीएच के प्रति संवेदनशील GFP के साथ मापा जाता है. एक fluorimeter में खमीर सेल निलंबन में प्रतिदीप्ति अनुपात की माप के लिए तरीके से वर्णित हैं. इन प्रोटोकॉल के माध्यम से, अलग अलग परिस्थितियों में या अलग खमीर म्यूटेंट में पीएच की एक समय बिंदु माप तुलना की गई है और समय के साथ पीएच में परिवर्तन नजर रखी गई है. इन तरीकों में भी उच्च throughput प्रयोगों के लिए एक प्रतिदीप्ति प्लेट पाठक प्रारूप करने के लिए अनुकूलित किया गया है. अन्य एपी से अधिक ratiometric पीएच माप के लाभवर्तमान में उपयोग, संभावित प्रयोगात्मक समस्याओं और समाधान, और इन तकनीकों का उपयोग भविष्य के लिए संभावनाओं में proaches भी वर्णित हैं.
Introduction
पीएच homeostasis को सभी जीवों 1,2 में एक गतिशील और उच्च विनियमित प्रक्रिया है. जैव रासायनिक प्रक्रियाओं कस पीएच द्वारा विनियमित रहे हैं, और intracellular वातावरण निवासी एंजाइमों का इष्टतम गतिविधि की अनुमति के लिए संकीर्ण पीएच सीमाओं को देखते हैं. हालांकि, intracellular पीएच homeostasis को पर्यावरण पीएच, चयापचय परिवर्तन, और कुछ संकेत दे रास्ते में तेजी से बदलाव के द्वारा चुनौती दी जा सकती है. इसके अलावा, intracellular पीएच एक महत्वपूर्ण संकेत के रूप में ही सेवा कर सकते हैं. अंत में, कई organelles के organelle विशिष्ट कार्यों के लिए आसपास के cytosol से अलग और आवश्यक हैं कि lumenal पीएच मान बनाए रखने के लिए.
उच्च यूकेरियोट्स 2 के साथ पीएच समस्थिति तंत्र की खमीर के शेयर एक नंबर. लाइसोसोमल / endocytic मार्ग की अम्लीय organelles में, पीएच मुख्य रूप से कई exchan के साथ मिलकर में अभिनय, अत्यधिक संरक्षित vacuolar प्रोटॉन translocating ATPase (वि ATPase) द्वारा नियंत्रित किया जाता हैपीएच ढाल पर निर्भर Gers. सभी कोशिकाओं को भी प्रोटॉन निर्यात तंत्र है. में फफूंद और पौधों, प्लाज्मा झिल्ली पर एक दूसरा, अलग प्रोटॉन पंप, Pma1, निर्यात चयापचय प्रोटॉन और साइटोसोलिक पीएच और प्लाज्मा झिल्ली क्षमता की प्रमुख निर्धारक माना जा रहा है. एस के आनुवंशिक लचीलापन cerevisiae और इसकी वाणिज्यिक महत्व, यह पीएच समस्थिति 2 के अध्ययन के लिए एक बहुत ही रोचक और महत्वपूर्ण मॉडल बना दिया है.
Organelle अम्लीकरण के प्राथमिक चालकों होने के अलावा, वि ATPases अत्यधिक एंजाइमों विनियमित रहे हैं और हमारे प्रयोगशाला वि ATPase विनियमन के तंत्र को समझने में दिलचस्पी है. इस लक्ष्य की दिशा में, हम vacuolar और साइटोसोलिक पीएच के vivo पीएच माप में उपयोग किया गया है: 1) परिवर्तन के प्रभाव है कि समझौता वि ATPase गतिविधि की जांच करने के लिए ग्लूकोज के अभाव और readdition, 2 के रूप में बदल बाह्य परिस्थितियों,) के लिए प्रतिक्रियाओं पर नजर रखने के लिए, और 3) Coor पता लगाने के लिएorganelle और प्लाज्मा झिल्ली प्रोटॉन पंप 3-5 की dination. इन प्रयोगों केवल खमीर कोशिकाओं में उपयोग करने के लिए उत्तरदायी मजबूत ratiometric पीएच संकेतकों के विकास के माध्यम से संभव हो गया. . स्तनधारी कोशिकाओं में साइटोसोलिक पीएच मापने के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है, जो, खमीर रिक्तिका में जम – संयंत्र एट अल पहली BCECF ((और 6) carboxyfluorescein 2'7'-बीआईएस (2 carboxyethyl) -5) से पता चला कि बजाय साइटोसॉल 6 की. BCECF स्थानीयकरण में यह अंतर BCECF-(ए. BCECF की acetoxymethyl एस्टर) और vacuolar प्रतिधारण 6 से acetoxy मिथाइल एस्टर की दरार के लिए संभावना जिम्मेदार हैं जो रिक्तिका में कई hydrolytic एंजाइमों, के लिए जिम्मेदार ठहराया गया है. अली एट अल. 7 आगे BCECF उपयोग कर vacuolar पीएच माप विकसित और एक प्रतिदीप्ति प्लेट पाठक प्रारूप करने के लिए इन मापों रूपांतरित किया. ब्रेट एट अल. एक प्लाज्मिड जनित आर व्यक्त खमीर में साइटोसोलिक पीएच मापने का एक साधन के रूप में खमीर pHluorin पेशएक खमीर विशिष्ट प्रमोटर 9 के नियंत्रण में atiometric पीएच संवेदनशील GFP 8.
BCECF और खमीर pHluorin दोनों की उत्तेजना स्पेक्ट्रा पीएच के प्रति संवेदनशील हैं, तो वे एक ही तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन पर मापा दो उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, पर प्रतिदीप्ति के अनुपात पीएच 8,10 के एक उपाय प्रदान करता है जिसमें ratiometric पीएच संकेतक के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं. ये खमीर vacuolar और साइटोसोलिक पीएच सेंसर दोनों एकल कोशिका और जनसंख्या के आधार पर माप के लिए इस्तेमाल किया गया है. एकल कक्ष माप 6,11 प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण से प्रदर्शन कर रहे हैं. दो तरंग दैर्ध्य में vacuolar या साइटोसोलिक प्रतिदीप्ति प्रत्येक कक्ष के लिए मापा जाता है. जनसंख्या के आधार पर माप उपयुक्त प्रतिदीप्ति क्षमताओं के साथ एक microplate रीडर या तो में या एक fluorimeter में प्रदर्शन कर रहे हैं. यह चुनाव के दौरान इस तरह के ग्लूकोज के रूप में घटकों के अलावा के लिए आसान पहुँच प्रदान करता है क्योंकि हम आम तौर पर, एक fluorimeter में हमारे मापन किया हैtinuous गतिज माप. Vacuolar और साइटोसोलिक पीएच की माप के लिए हमारे वर्तमान प्रयोगशाला प्रोटोकॉल नीचे सूचीबद्ध हैं, दोनों को भी आसानी से microplate assays के लिए अनुकूलित कर रहे हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
हम पीएच homeostasis के पहलुओं की संख्या पता करने के लिए इन प्रोटोकॉल का उपयोग किया है. उदाहरण के लिए, हम 4,5 जंगली प्रकार और वि ATPase की कमी उत्परिवर्ती कोशिकाओं की साइटोसोलिक और पीएच प्रतिक्रियाओं की तुलना में …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के प्रधानमंत्री केन को एनआईएच R01 GM50322 द्वारा समर्थित किया गया था. लेखकों हमारी प्रयोगशाला के लिए इन प्रोटोकॉल बाहर काम करने के लिए डॉ. Rajini राव, खमीर pHluorin प्लास्मिडों उपलब्ध कराने के लिए और ratiometric पीएच माप पर सलाह के लिए जॉन्स हॉपकिन्स विश्वविद्यालय, और डॉ. ग्लोरिया ए मार्टिनेज मुनोज़ धन्यवाद.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
Riferimenti
- Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
- Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
- Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
- Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
- Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
- Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
- Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
- Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5′(and 6′)-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1′(3’H)-isobenzofuran]-3′-one and 2′,7′-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
- Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
- Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
- Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
- Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
- Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
- Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).
- Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619 (2011).
- Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
- Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
- Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).
