Misurazione di pH vacuolare e di Cytosolic<em> In Vivo</em> In Lievito Cell Sospensioni
Summary
PH vacuolare e di citosolica può essere misurata in lieviti vivi (<em> S. cerevisiae</em>) Cellule utilizzando tinture fluorescenti raziometrici localizzate a specifici compartimenti cellulari. Noi descriviamo procedure per la misurazione del pH vacuolare di con BCECF-AM, la quale localizza al la vacuolo nel lievito, e del pH citosolico con un citosolica raziometrico GFP pH-sensibile al (lievito pHluorin).
Abstract
Vacuolare e di pH citosolica sono altamente regolamentati in cellule di lievito e di occupano un ruolo centrale nella complessiva omeostasi pH. Noi descriviamo i protocolli per la la misurazione raziometrica di del pH in vivo usando di pH-sensibili fluorofori localizzate al il vacuolo o di citosol. PH vacuolar viene misurata usando BCECF, che localizza al la vacuolo in lievito quando introdotto in cellule nella sua forma estere acetossimetil. PH citosolico è misurata con un GFP pH-sensibile al espressa sotto controllo di un promotore lievito, lievito pHluorin. Metodi di misura della rapporti di fluorescenza in sospensioni cellulari lievito negli una fluorimetro sono descritte. Attraverso questi protocolli, le misurazioni singole punto di tempo di pH in condizioni diversi o in differenti mutanti di lievito sono stati confrontati e di le variazioni di pH nel corso del tempo sono stati monitorati. Questi metodi sono stati anche adattati a una formato di lettore di piastre di fluorescenza per gli esperimenti di ad alta-di throughput. Vantaggi di misure di pH raziometrici oltre altri apsono anche descritti procci attualmente in uso, i potenziali problemi sperimentali e soluzioni, e le prospettive per uso futuro di queste tecniche.
Introduction
pH omeostasi è un processo dinamico e di altamente regolato in tutti gli organismi 1,2. Processi biochimici sono strettamente regolati da pH, e di ambienti di intracellulari sono sintonizzati ai range di di pH strette per consentire attività ottimale delle le enzimi residenti. Tuttavia, intracellulare pH omeostasi può essere contestata da rapidi cambiamenti in pH ambientale, turni di metabolici, e di alcuni vie di segnalazione. In aggiunta, pH intracellulare può servire di per sé come un segnale importante. Infine, molti organelli mantengono valori pH lumenal che sono distinti dal citosol circostante e essenziale per le funzioni organello-specifici.
Le lieviti Saccharomyces condivide cerevisiae un certo numero di meccanismi omeostasi pH con con eucarioti superiori 2. In gli organelli acide del il pathway endocitica / lisosomiale, pH è controllato in primo luogo dalla altamente conservata vacuolare protone-translocating ATPasi (V-ATPasi), agendo in tandem con molti scamgers dipendenti dal gradiente di di pH. Tutte le cellule eucariotiche hanno anche meccanismi di esportazione protonica. In funghi e piante, un secondo, pompa di protonica distinto a livello della membrana plasmatica, Pma1, le esportazioni protoni metaboliche e si crede di essere il maggiore fattore determinante di pH citosolica e di potenziale di membrana plasmatica. La flessibilità genetica di S. cerevisiae e la sua importanza commerciale, hanno reso esso un modello molto interessante e importante per lo studio pH l'omeostasi 2.
In Oltre ad essere i driver di primari di organello acidificazione, V-ATPasi di sono altamente regolamentati enzimi di e la il nostro laboratorio di è interessato a meccanismi di regolazione V-ATPasi la comprensione. Verso questo obiettivo, abbiamo sono state utilizzando di misure di pH in vivo di pH vacuolare e di citosolica: 1) a monitorare le risposte al mutevoli condizioni extracellulari, come ad esempio deprivazione glucosio e readdition, 2) ai esaminare gli effetti di mutazioni che compromesso di attività V-ATPasi, e di 3) per esplorare la coordinamento di degli organelli e di al plasma a membrana pompe protoniche 3-5. Questi esperimenti divennero possibile solo attraverso lo sviluppo di solidi indicatori di pH raziometrici suscettibili di utilizzare in cellule di lievito. . Pianta et al primo luogo ha mostrato che BCECF (2'7'-Bis-(2-carbossietil) -5 – (e 6)-carbossifluoresceina), che è stato usato ampiamente per misurare il pH citosolico in cellule di di mammifero, accumula nel vacuolo lievito anziché il citosol 6. Questa differenza nella BCECF localizzazione è stata attribuita ad le molte enzimi idrolitici in il vacuolo, che sono probabilmente responsabile per il clivaggio dell'estere metilico acetossi da BCECF-AM (estere acetossimetil di BCECF) e ritenzione vacuolare 6. Ali et al. 7 ulteriormente sviluppato di misura del pH vacuolare usando BCECF e adattati queste misurazioni per un formato di lettore di piastre di fluorescenza. Brett et al. Introdotta lievito pHluorin come un mezzo di misurare pH citosolico in lievito da esprimendo un r plasmide-borneatiometric GFP pH-sensibile al 8 sotto controllo di un lievito-specifico promotore 9.
La spettri di eccitazione di entrambi BCECF e di lievito pHluorin sono sensibili ai pH, in modo da essi sono utilizzati come indicatori di pH raziometrici in cui il rapporto di di fluorescenza presso due lunghezze d'onda di eccitazione, misurati ad una singola lunghezza d'onda di emissioni, fornisce una misura di pH 8,10. Questi sensori di pH vacuolari e di citosolica di lievito sono stati utilizzati per entrambe le misurazioni a cella singola e di basato sulla popolazione. Misurazioni monocellulari 6,11 sono eseguite da microscopia a fluorescenza e analisi di immagine. Fluorescenza vacuolar o citosolico presso i due lunghezze d'onda è misurato per ogni cella. Le misurazioni basati sulla popolazione vengono eseguite sia in un lettore di micropiastra con adeguate capacità di fluorescenza o in un fluorimetro. Noi abbiamo generalmente fatto i nostri misurazioni di in un fluorimetro, perché fornisce un facile accesso per aggiunta di componenti di come ad esempio glucosio durante condizionatamisurazioni di cinetiche continuo. I nostri protocolli di di laboratorio attuali per la misurazione di del pH vacuolare e di citosolica sono elencati di qui di seguito; entrambi sono anche facilmente adattati a saggi di per micropiastre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Noi abbiamo utilizzato questi protocolli per affrontare un certo numero di gli aspetti della pH omeostasi. Ad esempio, noi abbiamo confrontato le risposte citosoliche e di pH di cellule mutanti wild-type e V-ATPasi-carente 4,5. Abbiamo inoltre esaminato gli effetti delle condizioni di crescita alterati, di pH particolarmente extracellulare, sulla risposta del pH vacuolare al glucosio 3. È importante sottolineare che, le risposte che osserviamo sono entrambi coerenti con altri metodi di misurazione…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01 GM50322 a PM Kane. Gli autori ringraziano il Dr. Rajini Rao, Johns Hopkins University per la fornitura di le di lievito pHluorin plasmidi e di per un consiglio su misure di pH raziometriche, e di il Dr. Gloria A. Martinez Munoz per lavorare fuori questi protocolli per il nostro laboratorio.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
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