液胞と細胞質のpHの測定<emインビボで></em>酵母細胞懸濁液に
Summary
液胞と細胞質のpHは生酵母で測定することができる（<em> S.セレビ</em>）特定の細胞区画に局在レシオメトリック蛍光色素を用いて細胞。我々は、酵母における液胞に局在BCECF-AM、および細胞質レシオメトリックpH感受性GFP（酵母pHluorin）と細胞質のpHと液胞のpHを測定するための手順について説明します。
Abstract
液胞および細胞質ゾルのpHは非常酵母細胞で規定さおよび全体のpHホメオスタシスにおいて中心的な役割を占めるている。私たちは、液胞や細胞質に局在するpH感受性蛍光プローブを用いたin vivoでのpHのレシオメトリック測定のためのプロトコルを記述します。液胞pHは、そのアセトキシメチルエステルの形態で細胞に導入する際に、酵母液胞に局在BCECFを用いて測定される。細胞質ゾルのpHは、酵母プロモーターの制御下で発現pH感受性GFP、酵母pHluorinで測定される。蛍光中の酵母細胞懸濁液中の蛍光比の測定のための方法が記載されている。これらのプロトコルを介して、さまざまな条件の下で、または異なる酵母変異体のpHの単一時点の測定が比較され、経時的なpHの変化が監視されている。これらの方法は、高スループット実験のための蛍光プレートリーダーフォーマットに適応されている。他のAP上のレシオメトリックpH測定の利点現在使用され、潜在的な実験的な問題と解決策、およびこれらの技術の将来の使用のための見通しに近づくにつれても記載されている。
Introduction
pHの恒常性は、すべての生物1,2の動的かつ高度に調整されたプロセスである。生化学的プロセスは厳密にpH値によって規制されており、細胞内の環境が常駐酵素の最適な活性を可能にするために狭いpH範囲に同調される。しかし、細胞内pHの恒常性は、環境pHの急激な変化、代謝シフト、および特定のシグナル伝達経路によって挑戦することができます。また、細胞内のpHが重要なシグナルとしての地位を提供することができます。最後に、多くの細胞小器官は、周囲の細胞質は異なるとオルガネラ固有の機能に不可欠である内腔pH値を維持します。
酵母サッカロミセス·セレビシエ株高等真核生物2でpHの恒常性メカニズムの数。リソソーム/エンドサイトーシス経路の酸性オルガネラにおいて、pHは、主に多くのexchanと連携して作用する、高度に保存された液胞プロトンATPアーゼ転位（V-ATPアーゼ）によって制御されるpH勾配に依存ジェール。すべての真核細胞は、またプロトンエクスポートメカニズムを持っています。菌類や植物、形質膜の第二、別個のプロトンポンプ、PMA1、輸出プロトン代謝および細胞質のpHおよび細胞膜電位の主要な決定要因であると考えられている。 S.の遺伝的柔軟性出芽酵母とその商業的重要性は、それのpHホメオスタシス2を研究するための非常に興味深く、重要なモデルました。
オルガネラの酸性化の主な要因であることに加えて、V-ATPアーゼは、高度に規制された酵素であり、私たちの研究室では、V-ATPaseの調節のメカニズムを理解することに興味があります。この目標に向かって、私たちは、液胞と細胞質のpHの生体内 pH測定に使用してきました：1）変異の影響その妥協V-ATPアーゼ活性を調べるためにこのようなグルコース欠乏とreaddition、2などの変化外条件）への応答を監視するために、及び3）COORを探索するオルガネラと細胞膜プロトンポンプ3-5 dination。これらの実験は、酵母細胞での使用に適して堅牢なレシオメトリックpH指示薬の開発によって可能になった。 （ – （および6） -カルボキシフルオレセイン2'7'-ビス- （2 -カルボキシエチル）-5）、哺乳動物細胞において細胞質ゾルのpHを測定するために広く使用されている、酵母液胞に蓄積植物らは最初BCECFことを示した代わりに、細胞質ゾル6。 BCECFのローカライズにおけるこの差はおそらくBCECF-AM（BCECFのアセトキシメチルエステル）と液胞の保持6からアセトキシメチルエステルの開裂を担当する液胞の多くの加水分解酵素、に起因している。アリら 7は、さらに、BCECFを使用して、液胞pH測定を開発し、蛍光プレートリーダー形式にこれらの測定値を適合。プラスミド媒介Rを発現させることにより酵母の細胞質のpHを測定する手段としてブレットら導入された酵母pHluorinatiometric pH感受性酵母特異的プロモーター9の制御下にGFP 8。
BCECFおよび酵母pHluorin両方の励起スペクトルは、pHに敏感であるので、それらは単一の発光波長で測定された2つの励起波長での蛍光の割合でレシオメトリックpH指示薬として使用され、pHが8,10の尺度を提供する。これらの酵母液胞および細胞質ゾルのpHセンサは、シングルセルおよび人口ベースの測定のために使用されている。単一セルの測定は6,11蛍光顕微鏡と画像解析によって行われる。二つの波長における液胞または細胞質蛍光はセル毎に測定する。集団ベースの測定は、適切な蛍光機能を備えたマイクロプレートリーダーのいずれかで、または蛍光で実行されます。それは詐欺中グルコースなどのコンポーネントを追加するための簡単なアクセスを提供するため、我々は一般的に、蛍光で我々の測定を行っている連続運動測定。液胞および細胞質ゾルのpHの測定のための我々の現在の実験プロトコルは以下の通りです。両方も容易にマイクロプレートアッセイに適合される。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、pHホメオスタシスの態様の数に対処するために、これらのプロトコルを利用している。例えば、我々は、4,5野生型およびV-ATPアーゼ欠損変異体細胞の細胞質およびpH応答を比較した。我々はまた、グルコース、3〜胞のpH応答に改変された成長条件、特に外pHの影響を調べた。重要なことは、我々が観察応答が量的pH測定する他の方法と、プロトンポンプ活動の変化を説?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、PMケインにNIH R01 GM50322によってサポートされていました。著者は、私たちの研究室のために、これらのプロトコルを扱うための博士Rajiniラオ、酵母pHluorinプラスミドを提供するとレシオメトリックpH測定に関するアドバイスジョンズホプキンス大学、博士とグロリアA.マルティネスムニョスに感謝します。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
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