Måling af vacuolær og cytosoliske pH<em> In Vivo</em> I Gær cellesuspensioner

Summary

Vacuolær og cytosol pH kan måles i levende gær (<em> S. cerevisiae</em>) Celler under anvendelse af ratiometrisk fluorescerende farvestoffer lokaliseret til specifikke cellulære rum. Vi beskriver procedurerne for måling vacuolær pH ​​med BCECF-AM, som lokaliseres til vakuolen i gær, og cytosolisk pH med en cytosolisk ratiometrisk pH-følsom GFP (gær pHluorin).

Abstract

Vacuolær og cytosoliske pH er stærkt reguleret i gærceller og indtager en central rolle i den samlede pH homøostase. Vi beskriver protokoller til ratiometrisk måling af pH i vivo under anvendelse af pH-følsomme fluoroforer lokaliseret til vakuolen eller cytosolen. Vacuolær pH ​​måles med BCECF, som lokaliseres til vakuolen i gær, når den indføres i celler i sin acetoxymethylester formular. Cytosolisk pH måles med en pH-følsom GFP udtrykkes under kontrol af en gærpromotor, gær pHluorin. Metoder til måling af fluorescens nøgletal i gær celle suspensioner i et fluorimeter beskrevet. Gennem disse protokoller, enkeltdoser tidspunkt målinger af pH under forskellige forhold eller i forskellige gærmutanter blevet sammenlignet, og ændringer i pH over tid er blevet overvåget. Disse metoder er også blevet tilpasset til en fluorescenspladelæser format for høj-throughput eksperimenter. Fordele ved ratiometrisk pH målinger over andre APindfaldsvinkler bruges i øjeblikket, potentielle eksperimentelle problemer og løsninger, og udsigterne til fremtidig brug af disse teknikker er også beskrevet.

Introduction

pH homeostase er en dynamisk og stærkt reguleret proces i alle organismer ^1,2. Biokemiske processer er stramt reguleret af pH, og intracellulære miljøer er tunet til smalle pH-områder for at tillade optimal aktivitet af de residente enzymer. Dog kan intracellulær pH ​​homeostase blive udfordret af hurtige ændringer i miljøet pH, metaboliske forskydninger, samt visse signalveje. Desuden kan intracellulær pH ​​i sig selv tjene som et vigtigt signal. Endelig har mange organeller opretholde luminale pH-værdier, som er forskellige fra den omgivende cytosolen og afgørende for organel-specifikke funktioner.

Gær Saccharomyces cerevisiae deler en række pH homeostase mekanismer med højere eukaryoter ^2. I de sure organeller i endocytiske / lysosomale vejen er pH primært styret af højkonserveret vakuolær proton-translocating ATPase (V-ATPase), der optræder sammen med mange exchangers afhængige af pH-gradienten. Alle eukaryote celler også proton eksport mekanismer. I svampe og planter, et sekund, der adskiller proton pumpe på plasmamembranen, Pma1, eksport metaboliske protoner og menes at være den afgørende faktor for cytosol pH og plasma membran potentiale. Den genetiske fleksibilitet S. cerevisiae og dens kommercielle betydning, har gjort det til en meget interessant og vigtig model for at studere pH homeostase ^2..

Ud over at være de primære drivkræfter for organel forsuring, er V-ATPaser stærkt reguleret enzymer og vores lab er interesseret i at forstå mekanismerne i V-ATPase regulering. Til dette mål, har vi brugt in vivo pH målinger af vacuolær og cytosol pH: 1) at overvåge reaktioner på skiftende ekstracellulære forhold, såsom glucose afsavn og readdition, 2) at undersøge virkningerne af mutationer, der kompromitterer V-ATPase aktivitet, og 3) at udforske koordinering af organel og plasma membran protonpumperne ^3-5. Disse eksperimenter blev kun mulig gennem udvikling af robuste ratiometrisk pH indikatorer medgørlig at bruge i gærceller. . Plant m.fl. først viste at BCECF (2'7'-bis-(2-carboxyethyl) -5 – (og 6)-carboxyfluorescein), der har været anvendt bredt til at måle cytosolisk pH i pattedyrceller, ophobes i gær vakuolen i stedet for cytosol ^6.. Denne forskel i BCECF lokalisering er blevet tilskrevet de mange hydrolytiske enzymer i vakuolet, som sandsynligvis er ansvarlig for spaltning af acetoxy-methylester fra BCECF-AM (acetoxymethyl ester af BCECF) og vacuolær tilbageholdelse ^6.. Ali et al. ^7. videreudviklet vacuolær pH-måling med BCECF og tilpasset disse målinger til en fluorescenspladelæser format. Brett et al. Indført gær pHluorin som et middel til at måle cytosolisk pH i gær ved at udtrykke en plasmidbåret ratiometric pH-følsom GFP ⁸ under styring af en gær-promotor ^9.

Excitation spektre af både BCECF og gær pHluorin er følsomme over for pH, så de anvendes som ratiometrisk pH indikatorer, hvor forholdet af fluorescens ved to excitationsbølgelængder, målt på en enkelt emissionsbølgelængde, giver et mål for pH ^8,10. Disse gær vakuolære og cytosol pH-sensorer er blevet brugt til både encellede og populations-baserede målinger. Encellede målinger ^6,11 udføres af fluorescens mikroskopi og billedanalyse. Vacuolær eller cytosoliske fluorescens ved to bølgelængder måles for hver celle. De populationsbaserede Målingerne er udført i enten en mikropladeaflæser med passende fluorescens evner eller i et fluorimeter. Vi har generelt gjort vores målinger i et fluorimeter, fordi det giver nem adgang for tilsætning af komponenter såsom glucose under conbende kinetiske målinger. Vores nuværende lab protokoller for måling af vacuolær og cytosoliske pH er listet nedenfor, begge er også let tilpasses til mikroplatte assays.

Protocol

1. Måling af vacuolær pH in vivo under anvendelse BCECF-AM Dyrk en 50 ml flydende kultur af gærstammen, der skal måles i det ønskede medium natten over. Målet er at have celler i midten-log-fase (OD600 (optisk tæthed ved 600 nm) måling af cirka 0,8 til suspensionen). Pellet gærcellerne ved centrifugering. Pellet resuspenderes i 0,6 ml af vækstmediet og overførsel til et mikrocentrifugerør, der er blevet vejet tidligere. Pellet cellerne igen i en mikrocentrifuge ved 2.000 xg i 60…

Representative Results

Figur 1 viser vakuolære pH fremkomne data om vildtype gærceller dyrket i rigt medium (gærekstrakt-peptonagtig dextran, YEPD) til pH 5 med 50 mM MES. Vi ofte vokser cellerne i pufret medium, da pH-værdien af mediet kan ændre sig dramatisk i løbet af natten vækst, navnlig for minimalmedium, og vi har fundet, at pH af vækstmediet kan påvirke vakuolære pH reaktioner 3.. Men det er også acceptabelt for mange eksperimenter at dyrke cellerne i bufferet medium. 1A viser en…

Discussion

Vi har udnyttet disse protokoller for at løse en række aspekter af pH homeostase. For eksempel har vi sammenlignet cytosol og pH reaktioner vildtype og V-ATPase-mutant celler ^4,5. Vi har også undersøgt virkningerne af ændrede vækstbetingelser, især ekstracellulære pH, om vakuolær pH respons på glukose ^3.. Vigtigere er det, de svar vi observerer er både i overensstemmelse med andre metoder til kvantitativ måling af pH og biokemiske data, der beskriver ændrede aktiviteter protonpumperne….

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Spectrofluorometer	Horiba Jobin Yvon	Model Fluoromax-4	Temperature control and stirring capability are desirable.
BCECF-AM	Invitrogen/Molecular Probes	B1150	Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C
monensin	Sigma	M5273	Toxic.
nigericin	Sigma	N7143	Toxic.
MES	Sigma	M8250