Måling av vacuolar og cytosolic pH<em> In Vivo</em> I gjær cellesuspensjoner

Summary

Vacuolar og cytosolic pH kan måles i levende gjær (<em> S. cerevisiae</em>) Celler ved hjelp Ratiometrisk fluorescerende fargestoffer lokalisert til bestemte cellene. Vi beskriver prosedyrer for måling vacuolar pH med BCECF-AM, som lokaliserer til vakuole i gjær, og cytosolic pH med en cytosolic proporsjonal pH-sensitive GFP (gjær pHluorin).

Abstract

Vacuolar og cytosolic pH er sterkt regulert i gjærceller og okkupere en sentral rolle i den samlede pH homeostase. Vi beskriver protokoller for proporsjonal måling av pH in vivo ved hjelp av pH-sensitive fluorophores lokalisert til vakuole eller cytosol. Vacuolar pH er målt ved hjelp BCECF, som lokaliserer til vakuole i gjær når introdusert inn i celler i sin acetoksymetyl esterform. Cytosolic pH er målt med et pH-sensitive GFP uttrykt under kontroll av en gjær promoter, gjær pHluorin. Metoder for måling av fluorescens-forhold i gjærcelle-suspensjoner i et fluorimeter er beskrevet. Gjennom disse protokollene, enkeltdoser tidspunkt målinger av pH under forskjellige forhold eller i forskjellige gjær mutanter blitt sammenlignet og endringer i pH over tid har vært overvåket. Disse metoder har også blitt tilpasset til et fluorescens plateleser format for high-throughput eksperimenter. Fordeler med Ratiometrisk pH-målinger over andre apgangsmåter i bruk, potensielle eksperimentelle problemer og løsninger, og utsiktene for fremtidig bruk av disse teknikkene er også beskrevet.

Introduction

pH homeostase er en dynamisk og svært regulert prosess i alle organismer ^1,2. Biokjemiske prosesser er strengt regulert av pH, og intracellulære miljøer er innstilt til smale pH områder for å tillate optimal aktivitet av de fastboende enzymer. Imidlertid kan intracellulær pH ​​homeostase bli utfordret av raske endringer i miljø-pH, metabolske skift, og enkelte signalveier. I tillegg kan intracellulær pH ​​i seg selv tjene som et viktig signal. Til slutt, mange organeller opprettholde lumenal pH-verdier som er forskjellig fra det omkringliggende cytosol og avgjørende for organeller-spesifikke funksjoner.

Gjær Saccharomyces cerevisiae aksjer en rekke pH homeostase mekanismer med høyere eukaryoter ^to. I de sure organeller i endocytic / lysosomale vei, er pH primært styrt av svært konservert vacuolar proton-translocating ATPase (V-ATPase), som opptrer i tandem med mange exchangers avhengig av pH-gradienten. Alle eukaryote celler har også proton eksport mekanismer. I sopp og planter, et sekund, distinkt proton pump på plasma membran, Pma1, eksport metabolske protoner og antas å være den viktigste determinant av cytosolic pH og plasma membran potensial. Den genetiske fleksibilitet S. cerevisiae og dens kommersielle betydning, har gjort det til en svært interessant og viktig modell for å studere pH homeostase ^to.

I tillegg til å være de viktigste driverne av organeller forsuring, er V-ATPaser sterkt regulert enzymer og vår lab er interessert i å forstå mekanismene for V-ATPase regulering. Mot dette målet, har vi brukt in vivo pH-målinger av vacuolar og cytosolic pH: 1) å overvåke svar til skiftende ekstracellulære forhold, for eksempel glukose savn og readdition, 2) å undersøke effekten av mutasjoner som kompromiss V-ATPase aktivitet, og 3) for å utforske coornering av organellesystemer og plasma membran protonpumpene ^3-5. Disse eksperimentene bare ble mulig gjennom utvikling av robuste Ratiometrisk pH indikatorer mottagelig å bruke i gjærceller. . Plante et al først viste at BCECF (2'7'-bis-(2-karboksyetyl) -5 – (og 6)-karboksyfluorescein), som har blitt mye brukt for å måle cytosolisk pH i pattedyrceller, akkumuleres i gjær vakuole i stedet for den ^6. cytosol. Denne forskjell i BCECF lokalisering er blitt tilskrevet de mange hydrolytiske enzymer i vakuole, som sannsynligvis er ansvarlig for spalting av acetoksy-metylester fra BCECF-AM (acetoksymetyl ester av BCECF) og vacuolar retensjon ^6.. Ali et al. ^Syv videreutviklet vacuolar pH-måling med BCECF og tilpasset disse målingene til en fluorescens plateleser format. Brett et al. Innført gjær pHluorin som et middel for måling av cytosolisk pH i gjær ved å uttrykke et plasmid-borne ratiometric pH-sensitive GFP ⁸ under kontroll av en gjær-promoter ^ni.

Den eksitasjon spektra av begge BCECF og gjær pHluorin er følsomme for pH, slik at de brukes som Ratiometrisk pH-indikatorer hvor forholdet av fluorescens ved to eksitasjonsbølgelengdene, målt på en enkelt emisjonsbølgelengde, gir et mål på pH ^8,10. Disse gjær vacuolar og cytosolic pH-sensorer har vært brukt til både encellede og populasjonsbasert målinger. Encellede målinger ^6,11 er utført av fluorescens mikroskopi og bildeanalyse. Vacuolar eller cytosoliske fluorescens ved de to bølgelengder blir målt for hver celle. De befolkningsbaserte målinger er utført i enten en mikroplateleser med passende fluorescens evner eller i en fluorimeter. Vi har stort sett gjort våre målinger i en fluorimeter, fordi det gir enkel tilgang for tillegg av komponenter som glukose under conkontinuerlige kinetiske målinger. Vår nåværende lab protokoller for måling av vacuolar og cytosolic pH er listet nedenfor; begge er også lett tilpasses microplate analyser.

Protocol

1. Måling av vacuolar pH In Vivo hjelp BCECF-AM Driv en 50 ml væskekultur av gjærstammen som skal måles i det ønskede medium over natten. Målet er å ha celler i mid-log fase (OD600 (optisk tetthet på 600 nm) måling på ca 0,8 for suspensjon). Pellet gjærcellene ved sentrifugering. Resuspender pelleten i 0,6 ml vekstmedium og overføring til et mikrosentrifugerør som har blitt veiet tidligere. Pellet cellene igjen i en mikrosentrifuge ved 2000 xg i 60 sek. Supernatanten fjernes s?…

Representative Results

Figur 1 viser vacuolar pH-data fremskaffet på vill-type gjær celler dyrket i rikt medium (gjærekstrakt-pepton dekstran YEPD) bufret til pH 5 med 50 mM MES. Vi ofte vokser cellene i bufret medium på grunn av pH i mediet kan endres ganske dramatisk under over natten vekst, spesielt for minimalt medium, og vi har funnet at pH i vekstmediet kan påvirke vacuolar pH responser 3. Imidlertid er det også akseptabelt for mange forsøk for å dyrke cellene i ikke-bufret medium. Figur 1A</s…

Discussion

Vi har benyttet disse protokollene å ta opp en rekke aspekter ved pH homeostase. For eksempel har vi sammenlignet cytosolic og pH svar av vill type og V-ATPase-mangelfull muterte celler ^4,5. Vi har også undersøkt effekten av endrede vekstvilkår, særlig ekstracellulær pH, på vacuolar pH respons på glukose ^tre. Viktigere, responsen man observerer er begge i overensstemmelse med andre metoder for kvantitativ måling av pH og med biokjemiske data som beskriver endrede aktiviteter av protonpumpe…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Spectrofluorometer	Horiba Jobin Yvon	Model Fluoromax-4	Temperature control and stirring capability are desirable.
BCECF-AM	Invitrogen/Molecular Probes	B1150	Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C
monensin	Sigma	M5273	Toxic.
nigericin	Sigma	N7143	Toxic.
MES	Sigma	M8250