Mätning av vakuolär och cytosolisk pH<em> In Vivo</em> I jästcell Suspensioner
Summary
Vakuolär och cytosolisk pH kan mätas i aktiv jäst (<em> S. cerevisiae</em>) Celler med ratiometrisk fluorescerande färgämnen lokaliserade till specifika cellulära avdelningar. Vi beskriver förfaranden för mätning vakuolär pH med BCECF-AM, som lokaliserar till vakuolen i jäst, och cytosolisk pH med en cytosolisk ratiometrisk pH-känsliga GFP (jäst pHluorin).
Abstract
Vakuolär och cytosolisk pH är starkt reglerad i jästceller och intar en central roll i den övergripande pH homeostas. Vi beskriver protokoll för ratiometrisk mätning av pH in vivo med hjälp av pH-känsliga fluoroforer lokaliserade till vakuolen eller cytosolen. Vakuolär pH mäts med BCECF, som lokaliserar till vakuolen i jäst när de införs i celler i sin acetoximetylester formulär. Cytosoliskt pH mäts med en pH-känslig GFP uttryckt under kontroll av en jästpromotor, jäst pHluorin. Metoder för mätning av fluorescens förhållanden i suspensioner jästcell i en fluorimeter beskrivs. Genom dessa protokoll har enstaka tidpunkt mätningar av pH under olika förhållanden eller i olika jästmutanter jämförts och förändringar i pH över tiden har övervakats. Dessa metoder har också anpassats till en fluorescens plattläsaren format för hög genomströmning experiment. Fördelar med ratiometrisk pH-mätningar över andra apinfallsvinklar för närvarande är i bruk, eventuella experimentella problem och lösningar, samt utsikterna för framtida användning av dessa tekniker beskrivs också.
Introduction
pH homeostas är en dynamisk och starkt reglerad process i alla organismer 1,2. Biokemiska processer är tätt regleras av pH, och intracellulära miljöer är inställda snäva pH-områden för att möjliggöra optimal aktivitet för de inhemska enzymer. Däremot kan intracellulära pH homeostas att utmanas av snabba förändringar i miljön pH, metabola förändringar, och vissa signalvägar. Dessutom kan intracellulära pH sig utgöra en viktig signal. Slutligen, många organeller upprätthålla lumenal pH-värden som skiljer sig från den omgivande cytosolen och avgörande för organell-specifika funktioner.
Jästsvampen Saccharomyces cerevisiae delar ett antal mekanismer pH homeostas med högre eukaryoter 2. I de sura organeller i endocytiska / lysosomala vägen är pH främst styrs av starkt konserverade vakuolär proton-translokerande ATPas (V-ATPas), agerar tillsammans med många valutakursgers beroende av pH-gradienten. Alla eukaryota celler har också mekanismer proton export. I svampar och växter, en sekund, distinkt protonpumpshämmare vid plasmamembranet, Pma1, export metaboliska protoner och tros vara den avgörande faktorn för cytosolic pH och plasmamembran potential. Den genetiska flexibilitet S. cerevisiae och dess kommersiella betydelse, har gjort det en mycket intressant och viktig modell för att studera pH homeostas 2.
Förutom att vara de primära drivkrafterna för organell försurning, är V-ATPases regleras mycket enzymer och vårt labb är intresserad av att förstå mekanismerna hos V-ATPas förordning. Mot detta mål, har vi använt in vivo pH-mätningar av vakuolär och cytosolisk pH: 1) att övervaka svar på förändrade extracellulära förhållanden, såsom glukos deprivation och readdition, 2) att undersöka effekterna av mutationer som kompromiss V-ATPas-aktivitet, och 3) att utforska samordning av organell och plasmamembran protonpumpar 3-5. Dessa experiment blev möjlig endast genom utveckling av robusta ratiometrisk pH-indikatorer som lämpar sig för användning i jästceller. . Växt et al först visade att BCECF (2'7'-bis-(2-karboxietyl) -5 – (och 6)-karboxifluorescein), som har använts i stor utsträckning för att mäta cytosoliskt pH i däggdjursceller, ackumuleras i jästen vakuolen i stället för den cytosolen 6. Denna skillnad i BCECF lokalisering har tillskrivits många hydrolytiska enzymer i vakuolen, som sannolikt ansvariga för klyvning av acetoxy metylestern från BCECF-AM (acetoximetylester av BCECF) och vakuolär behålla 6. Ali et al. 7 vidareutvecklat vakuolär pH-mätning med hjälp BCECF och anpassat dessa mätningar till en fluorescens plattläsaren format. Brett et al. Introducerade jäst pHluorin som ett sätt att mäta cytosoliskt pH i jäst genom att uttrycka en plasmidburen ratiometric pH-känsligt GFP 8 under kontroll av en jäst-promotor 9.
Den excitationsspektra av både BCECF och jäst pHluorin är känsliga för pH, så de används som ratiometrisk pH-indikatorer i vilka förhållandet av fluorescens vid två exciteringsvåglängder, mätt vid en enda emissionsvåglängd, ger ett mått på pH 8,10. Dessa jäst vakuolära och cytosolisk pH-sensorer har använts för både encelliga och befolkning-baserade mätningar. Encelliga mätningar 6,11 utförs av fluorescens mikroskopi och bildanalys. Vakuolär eller cytosolisk fluorescens vid de två våglängderna mäts för varje cell. De populationsbaserade Mätningarna utförs i antingen en mikroplattläsare med lämpliga fluorescens kapacitet eller i en fluorimeter. Vi har generellt sett gjort våra mätningar i en fluorimeter, eftersom det ger enkel åtkomst för tillsättning av komponenter såsom glukos under kondiga kinetiska mätningar. Våra nuvarande lab protokoll för mätning av vakuolär och cytosolic pH är listade nedan, båda är också lätt anpassas till mikroplatt analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har utnyttjat dessa protokoll för att hantera ett antal aspekter av pH-homeostas. Till exempel har vi jämförde cytosoliska och pH-svaren av vildtyp och V-ATPas-deficient mutantceller 4,5. Vi har även undersökt effekterna av förändrade tillväxtförutsättningar, särskilt extracellulära pH, på vakuolär pH svar på glukos 3. Viktigt svaren vi observerar är både förenligt med andra metoder för kvantitativ pH-mätning och med biokemiska data som beskriver förändrade verksamhet proto…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH R01 GM50322 till PM Kane. Författarna tackar Dr Rajini Rao, Johns Hopkins University för att ge jästen pHluorin plasmider och för råd om ratiometrisk pH-mätningar, och Dr Gloria A. Martinez Munoz för att arbeta ut dessa protokoll för vårt labb.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Spectrofluorometer | Horiba Jobin Yvon | Model Fluoromax-4 | Temperature control and stirring capability are desirable. |
| BCECF-AM | Invitrogen/Molecular Probes | B1150 | Prepare a 12 mM stock in dry DMSO, store as aliquots at -20 °C |
| monensin | Sigma | M5273 | Toxic. |
| nigericin | Sigma | N7143 | Toxic. |
| MES | Sigma | M8250 |
Riferimenti
- Casey, J. R., Grinstein, S., Orlowski, J. Sensors and regulators of intracellular pH. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 50-61 (2010).
- Orij, R., Brul, S., Smits, G. J. Intracellular pH is a tightly controlled signal in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 933-944 (2011).
- Diakov, T. T., Kane, P. M. Regulation of vacuolar proton-translocating ATPase activity and assembly by extracellular pH. J. Biol. Chem. 285, 23771-23778 (2010).
- Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. Vacuolar and plasma membrane proton pumps collaborate to achieve cytosolic pH homeostasis in yeast. J. Biol. Chem. 283, 20309-20319 (2008).
- Tarsio, M., Zheng, H., Smardon, A. M., Martinez-Munoz, G. A., Kane, P. M. Consequences of loss of Vph1 protein-containing vacuolar ATPases (V-ATPases) for overall cellular pH homeostasis. J. Biol. Chem. 286, 28089-28096 (2011).
- Plant, P. J., Manolson, M. F., Grinstein, S., Demaurex, N. Alternative mechanisms of vacuolar acidification in H(+)-ATPase-deficient yeast. J. Biol. Chem. 274, 37270-37279 (1999).
- Ali, R., Brett, C. L., Mukherjee, S., Rao, R. Inhibition of sodium/proton exchange by a Rab-GTPase-activating protein regulates endosomal traffic in yeast. J. Biol. Chem. 279, 4498-4506 (2004).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
- Brett, C. L., Tukaye, D. N., Mukherjee, S., Rao, R. The yeast endosomal Na+K+/H+ exchanger Nhx1 regulates cellular pH to control vesicle trafficking. Mol. Biol. Cell. 16, 1396-1405 (2005).
- Owen, C. S. Comparison of spectrum-shifting intracellular pH probes 5′(and 6′)-carboxy-10-dimethylamino-3-hydroxyspiro[7H-benzo[c]xanthene-7, 1′(3’H)-isobenzofuran]-3′-one and 2′,7′-biscarboxyethyl-5(and 6)-carboxyfluorescein. Anal. Biochem. 204, 65-71 (1992).
- Dechant, R., et al. Cytosolic pH is a second messenger for glucose and regulates the PKA pathway through V-ATPase. Embo J. 29, 2515-2526 (2010).
- Gustavsson, M., Barmark, G., Larsson, J., Muren, E., Ronne, H. Functional genomics of monensin sensitivity in yeast: implications for post-Golgi traffic and vacuolar H+-ATPase function. Mol. Genet. Genomics. 280, 233-248 (2008).
- Kovac, L., Bohmerova, E., Butko, P. Ionophores and intact cells. I. Valinomycin and nigericin act preferentially on mitochondria and not on the plasma membrane of Saccharomyces cerevisiae. Biochim. Biophys. Acta. 721, 341-348 (1982).
- Braun, N. A., Morgan, B., Dick, T. P., Schwappach, B. The yeast CLC protein counteracts vesicular acidification during iron starvation. J. Cell Sci. 123, 2342-2350 (2010).
- Orij, R., Postmus, J., Beek, T. e. r., Brul, A., S, G. J., Smits, In vivo measurement of cytosolic and mitochondrial pH using a pH-sensitive GFP derivative in Saccharomyces cerevisiae reveals a relation between intracellular pH and growth. Microbiology. 155, 268-278 (2009).
- Zhang, Y. Q., et al. Requirement for ergosterol in V-ATPase function underlies antifungal activity of azole drugs. PLoS Pathog. 6, e1000939 (2010).
- Brett, C. L., et al. Genome-wide analysis reveals the vacuolar pH-stat of Saccharomyces cerevisiae. PLoS One. 6, e17619 (2011).
- Roberts, C. J., Raymond, C. K., Yamashiro, C. T., Stevens, T. H. Methods for studying the yeast vacuole. Methods Enzymol. 194, 644-661 (1991).
- Chan, C. Y., et al. Inhibitors of V-ATPase proton transport reveal uncoupling functions of tether linking cytosolic and membrane domains of V0 subunit a (Vph1p). J. Biol. Chem. 287, 10236-10250 (2012).
- Johnson, R. M., et al. Identification of inhibitors of vacuolar proton-translocating ATPase pumps in yeast by high-throughput screening flow cytometry. Anal. Biochem. 398, 203-211 (2010).
