Abbiamo sviluppato e validato un piccolo ingombro serie di chemostati in miniatura costruito da prontamente parti disponibili per basso costo. Risultati evoluzione fisiologiche e sperimentali sono stati simili a chemostati volumi più grandi. La matrice Ministat fornisce una piattaforma compatta, poco costoso, e accessibile per gli esperimenti chemostato tradizionali, genomica funzionale, e le applicazioni di screening chimici.
Chemostati sono sistemi di coltura continua in cui le cellule vengono coltivate in un ben ambiente controllato chimicamente costante dove è vincolato densità cultura limitando specifici nutrienti. 1,2 I dati chemostati sono altamente riproducibili per la misurazione dei fenotipi quantitative che forniscono un tasso di crescita e l'ambiente allo stato stazionario. Per queste ragioni, chemostati sono diventati strumenti utili per la messa a livello della fisiologia caratterizzazione attraverso l'analisi di espressione genica 3-6 e le altre caratteristiche di culture allo steady-state di equilibrio. 7 a lungo termine esperimenti chemostati può evidenziare traiettorie specifiche popolazioni microbiche adottano durante l'evoluzione adattativa in un ambiente controllato. Infatti, chemostati sono stati utilizzati per evoluzione sperimentale dalla loro invenzione. 8 Un risultato comune in esperimenti evoluzione è per ciascun replicato biologica di acquisire un repertorio di mutazioni. 9-13 Questa diversità suggerisce che c'è ancora molto da scoprire eseguendo esperimenti di evoluzione con velocità di gran lunga maggiore.
Vi presentiamo qui la progettazione e gestione di una relativamente semplice, a basso costo di serie chemostati-o miniatura Ministat-e convalidare il loro uso nella determinazione della fisiologia e in esperimenti di evoluzione con lievito. Questo approccio comporta una crescita di decine di chemostati scappare un singolo multiplex pompa peristaltica. Le colture sono mantenuti ad un volume di 20 ml di lavoro, che è pratico per una varietà di applicazioni. La nostra speranza è che l'aumento della produttività, riduzione costi, e fornendo costruzione dettagliate e istruzioni operative può anche motivare la ricerca e l'applicazione industriale di questo progetto come una piattaforma generale per caratterizzare funzionalmente un gran numero di ceppi, specie, e parametri di crescita, oltre che genetica o farmaci biblioteche.
La dinamica della crescita microbica e l'evoluzione sono fondamentali per microbiologia, ecologia, genetica e biotecnologie. Il metodo più comune di microbi coltura è in batch, in cui vengono inoculate cellule a bassa densità in brodo ricco di sostanze nutritive e cresciuta a saturazione. Anche se semplice da effettuare con attrezzature standard di laboratorio, colture in lotti sperimentare un ambiente fluttuante chimica e di conseguenza cambiando fisiologia cellulare. Questo ambiente eterogeneo crescita può provocare effetti secondari di crescita e lo stress che possono mascherare sottili differenze fisiologiche. L'evoluzione sperimentale di trasferimento lotto di serie è possibile selezionare per le miscele complesse di crescita in fase sottopopolazioni specifiche, complicando i tentativi di connessione adattamenti a specifiche condizioni selettive. Misurazione dei fenotipi quantitativi può essere difficile a causa del rumore da calendario di campionamento imprecisa e variazione di caratteristiche come tempo di ritardo. Culture continui fornire un'alternativaregime di crescita in cui le cellule possono essere coltivate riproducibile in un ambiente chimicamente omogenea ad un tasso di crescita definito per raggiungere uno stato fisiologico stazionario. Grazie a questi vantaggi, studi di evoluzione sperimentale e caratterizzazione di stato cellulare utilizzano spesso l'ambiente controllato di coltura continua come il chemostato 14.
Punteggio di questi vantaggi ha portato ad un ritorno di interesse in culture chemostato. 15 Sin dalla loro introduzione nel 1950, 1,2 chemostato sistemi sono stati sviluppati per funzionare su una varietà di scale che vanno da litri al microlitri e per una varietà di applicazioni. 16 -19 Questi disegni diversi, che vanno dalla bioreattori prodotti commercialmente alle navi glassblown personalizzati per piattaforme microfluidica, la quota di principi generali di progettazione. Camera di coltura viene agitata e aerato (di solito facendo gorgogliare aria attraverso di esso) ed i microbi esso contenute siano mantenute omogenealy dispersa la camera di coltura in ogni momento. Mezzo fresco di composizione viene aggiunto continuamente e la velocità di aggiunta controlla il tasso di crescita e influenza l'ambiente chimico sperimentato dalla cultura. Un overflow imposta il volume di coltura nel tubo di crescita, e attraverso questo overflow la cultura saranno campionati con la stessa velocità con cui entra in terreno fresco. In questo modo le culture raggiungere in breve tempo uno stato fisiologico stabile in cui molti parametri biologici restano costanti. Nonostante i vantaggi di chemostati e le relazioni di queste diverse piattaforme presenti in letteratura, l'adozione diffusa è stata limitata dalla difficoltà di costruzione e gestione di questi sistemi, e gli elevati costi connessi con i commerciali. Inoltre, le descrizioni di come creare e utilizzare questi dispositivi possono essere opachi.
Presentiamo i disegni e le istruzioni per l'uso di un piccolo ingombro serie di chemostati in miniatura costruito da ricambi facilmente disponibili a basso costo. Abbiamo obsErve parametri sperimentali altamente coerenti e risultati riproducibili quando si confrontano il nostro dispositivo con i dati riportati per il lievito in coltura in bioreattori grandi volumi commerciali. Questo include riproducibilità di fisiologia cellulare come visto attraverso il raggiungimento dello stato di equilibrio stazionario entro 10-15 generazioni e ottenendo densità cultura simile all'equilibrio. Inoltre, i modelli di espressione genica sono coerenti tra Ministat e uno spot per più ampi volumi di piattaforma. Stabilità del tasso di diluizione, la densità ottica e la riproducibilità di espressione genica tra le tre culture repliche dimostrare la robustezza della nostra piattaforma. Abbiamo anche dimostrato che le stesse mutazioni adattive insorgere simili tempi di evoluzione sperimentali con chemostati volumi più grandi.
Coltivazione chemostato nelle Ministat, come con qualsiasi chemostato, richiede attenzione per i dettagli e la risoluzione dei problemi. Dal momento che la contaminazione è di grande preoccupazione in esperimenti di coltura continua, di solito cercare tramite microscopio per la contaminazione batterica e fungina su inoculazione e ogni 50 generazioni durante esperimenti a lungo termine evoluzione. Ad oggi non abbiamo osservato contaminazione tra 96 esperimenti evoluzione maggiore di 300 generazioni (dati non mostrati). Per verificare la contaminazione incrociata tra Ministat e il potenziale di microbi di colonizzare la camera di coltura tramite la linea effluente correvamo 16 Ministat tali che ogni altra Ministat stato inoculato con lievito come sopra e il resto non sono stati inoculati con qualsiasi cultura. Le colture sono state campionate in un contenitore di rifiuti urbani, che è stato svuotato ogni altro giorno. Quindi, se fosse possibile per i contaminanti di entrare attraverso la linea di scarichi che probabilmente avrebbe osservato che in questo experiment. Nel corso di tre settimane e più di 100 generazioni di crescita in questo schema a scacchiera di colture inoculate e non inoculate non abbiamo osservato la crescita non inoculate provette di coltura Ministat, suggerendo che la contaminazione da lieviti dall'esterno o altri microbi è improbabile che si verifichi in esperimenti di tempi simili.
Anche se le Ministat sono stati progettati per operare in modo analogo a chemostati commerciali, la natura modulare di questa disposizione permette di ottimizzare per soddisfare le esigenze degli utenti e di bilancio. La pompa peristaltica utilizzata in questo protocollo può ottenere portate tra 0,0186 vol / hr a 3,6 vol / hr (dati non mostrati). Un maggiore controllo dei tassi di diluizione potrebbe essere realizzato con modelli di pompe alternative. Si noti che il funzionamento a bassi tassi di diluizione può richiedere la sostituzione di un ago calibro maggiore per ottenere la stessa frequenza di consegna goccia. Dimensione della popolazione è un fattore importante per la corretta progettazione di esperimenti di evoluzione.Il tasso di diluizione standard e la concentrazione dei nutrienti qui utilizzato fornisce una taglia popolazione relativamente grande (~ 10 9 cellule) dello stesso ordine di grandezza di studi pubblicati evoluzione. 11 popolazioni più grande o più piccolo potrebbe essere mantenuta modificando il volume di lavoro o limitando la concentrazione dei nutrienti. Fornitura mutazione aumentato potrebbe anche essere ottenuto lavorando con ceppi con elevati tassi di mutazione.
Le Ministat potrebbe anche essere migliorata nel corso nostro sistema attuale. Ad esempio, in grado di raccogliere condensa sulle pareti del tubo di coltura e può essere notevolmente ridotto utilizzando un bagno d'acqua profonda, incubatore, o ambiente a temperatura costante. Sebbene aggregazione e la crescita parete in solfato culture limitate sembra essere relativamente rare, appare in 5/48 esperimenti di evoluzione da 300 generazioni (dati non mostrati), una varietà di tensioattivi sono disponibili che può essere di aiuto nel ridurre o ritardare questo tratto. Nel caso in cui interferisce con agglomerante cultura adeguatamiscelazione, agitazione maggiore può essere ottenuto riducendo il numero di modi viene diviso ogni pompa di aria, o aggiungendo un apparato agitazione. Sonde aggiuntive per la concentrazione di gas disciolto, pH o altri parametri possono anche essere inclusi, come in alcuni altri disegni 17.
Nonostante le modifiche possibili, in base alle Ministat come descritto in questo protocollo, abbiamo osservato parametri sperimentali altamente coerenti e risultati riproducibili quando si confrontano il nostro dispositivo con i dati riportati per chemostati volume maggiore commerciali. Questo incluso riproducibilità di fisiologia cellulare come visto attraverso il raggiungimento dello stato di equilibrio stazionario entro 10-15 generazioni (Figura 2A) e ottenendo densità cultura simile all'equilibrio. Pattern di espressione genica erano coerenti tra biologico tre repliche in Ministat e tra Ministat e commerciali di grande volume piattaforme (Figura 2B), con l'eccezione di geni metabolismo del ferro. Questi expression differenze sono probabilmente causati da cambiamenti nel contenuto di metallo tra i due dispositivi o miglioramento della qualità degli ingredienti media. I nostri dati suggeriscono che Ministat sarà utile per esperimenti di fisiologia o della concorrenza in cui è richiesto un ambiente coerente.
Per verificare se il disegno Ministat è sufficiente per applicazioni sperimentali evoluzione ci siamo evoluti culture sotto limitazione solfato per 250 generazioni e utilizzato CGH per caratterizzare l'amplificazione a livello del locus SUL1 -. Un segno distintivo di evoluzione a lungo termine in queste condizioni in chemostati di quantitativi maggiori 10 Abbiamo osservato amplificazione di SUL1 nei cloni da 4/4 esperimenti indipendenti in evoluzione solfato-limitati mezzi di comunicazione (Figura 2C). Nel suo insieme questi dati suggeriscono che Ministat sono una solida piattaforma che può essere utile per una varietà di applicazioni chemostato tradizionali. Anche se abbiamo dimostrato il loro uso in coltura di lievito in erba, i Ministat dovrebberoanche compatibile con altri organismi e disegni simili sono stati effettivamente utilizzati per la coltura di batteri e le specie di lievito altri. 16,17,25 Inoltre il volume più piccolo e cultura correlata ridotto bisogno di mezzi di comunicazione possono Ministat un'alternativa interessante per esperimenti che richiedono costosi o esotici reagenti come può essere il caso in chimica o schermi genetici.
The authors have nothing to disclose.
La creazione del video è stato sostenuto dalle concessioni dal National Center for Research Resources (5P41RR011823-17) e l'Istituto Nazionale di General Medical Sciences (8 P41 GM103533-17) dal National Institutes of Health. Questo lavoro è stato sostenuto anche da NSF concedere 1120425. MJD è Rita Allen Foundation Scholar. AWM è sostenuto in parte dal NIH T32 HG00035. Ringraziamo Sole Anna per l'assistenza al miglioramento dei protocolli. Inoltre, riconosciamo Sara DiRienzi, Celia Payen, e Amy Sirr come primi utenti dei Ministat.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
3/32″ x 7/32″ silicone tubing | VWR | 63009-260 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
1/2″ x 5/8″ silicone tubing (extra large) | VWR | 63009-299 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
1/4″ x 3/8″ silicone tubing (medium) | VWR | 63009-279 | Tubing: Order: (50′ coil pack) |
Orange green marprene pump tubing | Watson-Marlow | 978.0038.00+ | Tubing: Order: 6x(pack of 6) |
Female luer, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45500-04 | Connectors: Order: 4x(pack of 25) |
Male luer lock, 1/8″ barb | Cole Parmer | HV-45503-04 | Connectors: Order: 1x (pack of 25) |
Reducing connector, PVDF, 1/4″ to 1/8″ | Cole Parmer | EW-30703-50 | Connectors: Order: 1x (pack of 10) |
Barbed Y connector, 1/8″ ID | Cole Parmer | HV-30703-92 | Connectors: Order: 3x(pack of 10) |
Medium tubing clamps | VWR | 63022-405 | Clamps: Order: 1x(pack of 12) |
Day Pinchcock (metal clamp for tubing) | VWR | 21730-001 | Clamps: Order: 1x(pack of 10) |
Male inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. | Fisher | 05-112-39 | Connectors: Order: 1x(pack of 25) |
Female inline valved quick-connector, Fits tubing: 1/4 in. I.D.,Polypropylene | Fisher | 05-112-37 | Connectors: Order: 1x(pack of 5) |
Silent Air Pumps | Aquarium Guys.com | 212422 | Air Supply: Order: 4 pumps |
PTFE filters, 0.45 μm, for air filtration | Cole Parmer | HV-02915-22 | Air Supply: Order: 1x(box of 100) |
1L Flask with sidearm | Fisher | 10-181F | Air Supply: Order: 2x(Pack of 6) |
#8 silicone stopper, 3/8 in hole, for sidearm flasks | Fisher | K953715-0801 | Air Supply: Order: 8 stoppers |
4-Port manifold | Cole Parmer | EW-06464-85 | Air Supply: Order: 8 manifolds |
55 ml Screw cap culture tubes | Corning Life Sciences | 9825-25 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 48) |
Regular hypodermic white hub needle, 16G, 5 in. length for effluent line | Fisher | 14-817-105 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
Spinal tap needle | VWR | BD40836 | Culture Chamber: Order: 4x(pack of 10) |
Regular hypodermic pink needle | Fisher | 14-817-104 | Culture Chamber: Order: 1x(pack of 100) |
Foam Silicone stopper size “2”, pink | Cole Parmer | EW-06298-06 | Culture Chamber: Order: 2x(pack of 20) |
8-Well tube Rack | VWR | 82024-452 | Culture Chamber: Order: 4 racks |
10L Reservoir bottle with bottom hose outlet: vacuum safe | VWR | 89001-530 | Media: Order: 2 or more |
Yellow foam silicone stopper, non-standard size 12 | Cole Parmer | EW-06298-22 | Media: Order: 2 or more |
Carboy Venting Filter | Fisher | SLFG 050 10 | Media: Order: 1x(pack of 10) |
Electrical tape, green | Amazon.com | 10851-BA-10 | Media: Order 1 roll. |
Bottle top filter, 1L, .2 μm, 45 mm | VWR | 29442-978 | Media: Order: (1 case of 12) |
5000 ml Reservoir bottle with bottom outlet: vacuum safe | VWR | 89003-384 | Media: (Optional) |
Blue Foam Silicone stopper, nonstandardsize 10 1/2 | Cole Parmer | EW-06298-18 | Media: (Optional) |
205S/CA16, 16 Cartridge pump | Watson-Marlow | 020.3716.00A | Media Pump: Order: 1 |
16-channel 205CA Extension pump head | Watson-Marlow | 023.1401.000 | Media Pump: Order: 2 extension pump heads |
Silicone aquarium sealer | Fisher | S18180B | Media Pump: Order: 1 |
6-block dry bath | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 2 for 32 ministats or 1 for 16. |
Block for drybath, 6 x 25 mm test tube per block | VWR | 12621-120 | Heatblock: Order: 12 for 32 ministats or 6 for 16. |
Nylon Membrane Filters, 0.45 μm Pore Size; Dia.: 25 mm | Fisher | R04SP02500 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
Nylon Membrane Filters,0.45 μm Pore Size; 45 mm | Fisher | R04SP04700 | Harvesting: Order: 1x(pack of 100) (optional) |
47 mm, large filter apparatus | Fisher | XX10 047 30 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Glass filter holder, 25 mm, small filter apparatus | VWR | 26316-692 | Harvesting: Order: 1 (optional) |
Dewar flask, 1L for Liquid Nitrogen | VWR | 63380-052 | Harvesting: Order: 1 (optional) |