嵌入后突触蛋白的免疫标记海马切片培养
Summary
蛋白质的定位和分布提供了重要的信息，了解他们的细胞功能。可以使用电子显微镜（EM）的优越的空间分辨率，以确定一个给定的抗原后免疫组化的亚细胞定位。对于组织的中枢神经系统（CNS），保持结构完整性的同时保持抗原性已经在EM研究特别困难。在这里，我们采用的程序已经被用来保存在中枢神经系统的研究和定性大鼠海马CA1锥体神经元突触蛋白的结构和抗原。
Abstract
在亚细胞水平研究生物分子免疫电镜是一个功能强大的工具。耦合到电子致密如胶体金标记的抗体，可以揭示在各种组织中的特定的抗原1的定位和分布。两个最广泛使用的技术是预嵌入和嵌入后的技术。在预嵌入免疫金电子显微镜（EM）技术中，组织必须透性以允许抗体渗透之前，它被嵌入。这些技术是理想的保护结构，而且渗透力差的抗体（通常只有几微米）是一个很大的缺点2。后嵌入标记方法可以避免这个问题，因为标签上发生的部分固定的组织抗原更容易获得。多年来，多次修改，完善后的嵌入方法，以提高免疫，并保留超微结构<suP> 3-5。
组织固定EM研究的重要组成部分。固定剂的化学交联的大分子锁定的组织结构。固色剂的选择不仅影响结构保存，但也抗原性和对比度。几十年来，四氧化锇（OSO 4），甲醛，和戊二醛已被标准的固定剂，包括中枢神经系统（CNS）的组织，尤其是在化学和物理处理过程中容易产生结构损伤。不幸的是，OSO 4是反应性高的，并已被证明，以掩盖抗原6，从而导致在穷人和不足的标签。替代方法来避免化学固定，包括冻结的组织。但是，这些技术是难以执行，并需要昂贵的仪器。为了解决这些问题中的某些问题，并提高CNS组织标签，Phend 等 。 OSO 4醋酸铀（UA）和单宁的ACI代替D（TA），并成功地引入了额外的修改，以提高抗原检测的敏感性和结构保存在大脑和脊髓组织7。我们都采用了这种锇后埋线法对大鼠脑组织和优化的探测和研究突触蛋白的免疫胶体金标记技术。
我们在座的方法来确定大鼠海马CA1锥体神经元突触蛋白的超微结构定位。我们使用海马切片培养的切片。这些切片保持的trisynaptic的的电路的海马，从而学习突触可塑性是特别有用的，一个机制，人们普遍认为，学习和记忆的基础。如前所述8，可以制备从出生后的第5和6天小鼠/大鼠幼仔器官型海马切片，以及急性击倒或过度表达的外源蛋白是特别有用的。我们以前使用过该协议的通道aracterize的NG（NG），神经元特异性蛋白的关键作用，在调节突触功能8,9。我们还用它来 描述的超微结构定位钙调素（CAM）和Ca 2 + /钙调素依赖性蛋白激酶II（CaMKII）10。所示的结果，该协议允许的树突棘超微结构的保存和高效的标签，吴，，帮助刻画其分布在脊柱8。此外，这里所描述的过程可以有广泛的适用性，在研究参与神经元功能的许多其他蛋白质。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这个协议中，我们采取了Phend和Weinberg方法，对大脑和脊髓组织，研究在大鼠海马脑片培养的树突棘。在海马CA3-CA1区树突棘是脆弱的结构，包含一个庞大的多种蛋白质中发挥重要作用，在调节神经功能。所提出的方法提供了一个平衡的方法，用于实现增强的抗原性，同时保持良好的的超微结构保存（图2A），允许合理的标记效率和良好的再现性，可用于脊柱内的特定抗原的分布特征?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者要感谢马修佛罗伦萨准备的海马切片培养。这项工作是由美国国家老龄问题研究所和阿尔茨海默氏症协会NZG补助。
Materials
| NAME OF REAGENT | COMPANY | CATALOG NUMBER | |
| 60 x 15 mm polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Disposable scalpel | EXELINT | 29552 | |
| Cell culture inserts | Millipore | PICM03050 | |
| 10 nm Goat-anti-rabbit gold | Electron Microscopy Sciences | 25108 | |
| Anti-Neurogranin antibody | Millipore | AB5620 | |
| 100% Picric acid | Electron Microscopy Sciences | 19550 | |
| 96% Paraformaldehyde | Acros Organics | AC41678-0030 | |
| 25% Glutaraldehyde (EM grade) | Sigma | G5882 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400 | |
| p-Phenylenediamine | Sigma | P6001 | |
| Platinum (IV) chloride | Sigma | 379840 | |
| Tannic acid | Electron Microscopy Sciences | 21710 |
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