Post-embedding Etichettatura immuno di proteine ​​sinaptiche in Culture Slice ippocampali

Ling Zhong; Joshua C. Brown; Clive Wells; Nashaat Z. Gerges

doi:10.3791/50273

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Articolo metodologico

Post-embedding Etichettatura immuno di proteine sinaptiche in Culture Slice ippocampali

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DOI:

10.3791/50273

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3 aprile 2013

Ling Zhong¹ , Joshua C. Brown¹ , Clive Wells² , Nashaat Z. Gerges¹

¹Department of Cell Biology, Neurobiology and Anatomy, Medical College of Wisconsin , ²Department of Microbiology and Molecular Genetics, Medical College of Wisconsin

In questo articolo

Sommario

La localizzazione e la distribuzione delle proteine forniscono informazioni importanti per la comprensione delle loro funzioni cellulari. La superiore risoluzione spaziale di microscopia elettronica (EM) può essere utilizzato per determinare la localizzazione subcellulare di un dato antigene immunoistochimica seguito. Per tessuti del sistema nervoso centrale (CNS), preservando l'integrità strutturale mentre antigenicità mantenendo è stato particolarmente difficile in studi EM. Qui, si adotta una procedura che è stata usata per conservare le strutture e gli antigeni del sistema nervoso centrale per studiare e caratterizzare le proteine sinaptiche nel ratto CA1 dell'ippocampo neuroni piramidali.

Abstract

Microscopia Immunoelectron è un potente strumento per studiare molecole biologiche a livello subcellulare. Anticorpi accoppiati elettroni dense marcatori come oro colloidale può rivelare la localizzazione e la distribuzione di antigeni specifici in vari tessuti ^1. Le due tecniche più utilizzate sono pre-embedding e post-embedding tecniche. In pre-embedding immuno-microscopia elettronica (EM) tecniche, il tessuto deve essere permeabilizzate per consentire la penetrazione di anticorpi prima di essere incorporato. Queste tecniche sono l'ideale per conservare le strutture, ma scarsa penetrazione dell'anticorpo (spesso solo i primi micrometri) è uno svantaggio notevole ^2. I post-embedding metodi di etichettatura possibile evitare questo problema perché l'etichettatura avviene su sezioni di tessuti fissati in cui gli antigeni sono più facilmente accessibili. Nel corso degli anni, una serie di modifiche hanno migliorato le post-embedding metodi per migliorare e preservare immunoreattività ultrastruttura Fissazione dei tessuti è una parte cruciale di studi EM. Fissativi chimicamente reticolare le macromolecole per bloccare le strutture di tessuto in posizione. La scelta di fissativo influenza non solo la conservazione strutturale ma anche antigenicità e contrasto. Tetrossido di osmio (OsO _4), formaldeide e glutaraldeide sono stati i fissativi standard per decenni, anche per il sistema nervoso centrale (SNC), tessuti che sono particolarmente inclini a danni strutturali durante la lavorazione chimica e fisica. Purtroppo, OsO ₄ è altamente reattivo e ha dimostrato di mascherare antigeni ^6, con conseguente etichettatura povero e insufficiente. Approcci alternativi per evitare la fissazione chimica comprendono il congelamento dei tessuti. Ma queste tecniche sono difficili da eseguire e richiedono strumentazione costosa. Per risolvere alcuni di questi problemi e di migliorare tessuto del SNC etichettatura, Phend et al. sostituito OsO ₄ con acetato di uranile (UA) e tannico acid (TA), e introdotto con successo ulteriori modifiche per migliorare la sensibilità della rilevazione dell'antigene e conservazione strutturale nel cervello e del midollo spinale ^7. Abbiamo adottato questo osmio senza post-embedding metodo al tessuto del cervello di ratto e ottimizzato la tecnica immunogold etichettatura per rilevare e studiare le proteine sinaptiche.

Vi presentiamo qui un metodo per determinare la localizzazione ultrastrutturale delle proteine sinaptiche nel ratto CA1 dell'ippocampo neuroni piramidali. Usiamo organotipiche fettine di ippocampo in coltura. Queste fette mantenere la circuiteria trisynaptic dell'ippocampo, e quindi sono particolarmente utili per studiare la plasticità sinaptica, un meccanismo ampiamente pensato alla base dell'apprendimento e della memoria. Organotipiche fettine ippocampali di postnatali giorni 5 e 6 di topo / ratto cuccioli possono essere preparati come descritto in precedenza ^8, e sono particolarmente utili per acutamente knockdown o esprimono molti proteine esogene. Abbiamo già usato questo protocollo per characterize neurogranin (Ng), un neurone-specifica proteina con un ruolo critico nella regolazione della funzione sinaptica ^8,9. Abbiamo anche usato per caratterizzare la localizzazione ultrastrutturale di calmodulina (CaM) e Ca ^{2 +} / CaM-dipendente proteina chinasi II (CaMKII) ^10. Come illustrato nei risultati, questo protocollo permette una buona conservazione ultrastrutturale delle spine dendritiche e l'etichettatura efficiente del Ng per caratterizzare la sua distribuzione nella colonna vertebrale ^8. Inoltre, la procedura qui descritta può avere un'ampia applicabilità in studio molte altre proteine coinvolte in funzioni neuronali.

Protocollo

1. Fissazione

Fissativi sono cancerogene, indossare guanti e gestire i fissativi in una cappa aspirante. Se non diversamente specificato, tutte le incubazioni sono effettuate su tutte le soluzioni ghiaccio e deve essere filtrata prima dell'uso. Utilizzare microscopia elettronica di grado reagenti.

Giorno 1

Dopo condizioni sperimentali (ad esempio iniezione virale, trattamento farmacologico), posizionare la membrana con organotipiche fettine di ippocampo in un 60 x 15 millimetri capsula di Petri in polistirolo contenente ghiacciata 0.1 M tampone fosfato (tampone fosfa....