Generatie van Aligned Functionele myocardweefsel Door microcontact afdrukken
Summary
De generatie van uitgelijnde myocardiale weefsel is een belangrijke voorwaarde voor het aanpassen van de recente ontwikkelingen in de stamcel biologie om klinisch bruikbare doeleinden. Hierin beschrijven we een microcontact afdrukken benadering voor de nauwkeurige controle van cellulaire vorm en functie. Met behulp van zeer zuivere populaties van embryonale stamcellen afgeleid cardiale voorlopercellen, we dan het genereren van anisotrope functionele myocardium.
Abstract
Geavanceerde hartfalen is een belangrijke onvervulde klinische uitdaging, die voortvloeien uit het verlies van levensvatbare en / of volledig functionele hartspiercellen. Ondanks optimale medicamenteuze therapie, hartfalen is een belangrijke oorzaak van mortaliteit en morbiditeit in de ontwikkelde wereld. Een belangrijke uitdaging in de ontwikkeling van geneesmiddelen is de identificatie van cellulaire assays die nauwkeurig recapituleren normale en zieke menselijke hartspier fysiologie in vitro. Ook de grote uitdagingen in de regeneratieve cardiale biologie draaien rond de identificatie en isolatie van patiënt-specifieke cardiale voorlopercellen in klinisch relevante hoeveelheden. Deze cellen moeten vervolgens worden samengevoegd tot functioneel weefsel dat lijkt op het oorspronkelijke hartweefsel architectuur. Microcontact afdrukken het mogelijk maakt van nauwkeurige micropatterned eiwit vormen die lijken structurele organisatie van het hart, waardoor geometrische signalen om celhechting ruimtelijk controleren. Hierinbeschrijven we onze aanpak voor de isolatie van sterk gezuiverde myocardiale cellen van pluripotente stamcellen differentiëren in vitro, het genereren van celgroei oppervlakken micropatterned met extracellulaire matrix eiwitten en de montage van de stamcel-afgeleide hartspiercellen in anisotrope myocardium.
Introduction
Ondanks de recente vooruitgang in de medische therapie, geavanceerde hartfalen blijft een belangrijke oorzaak van mortaliteit en morbiditeit in de ontwikkelde wereld. De klinische komt voort uit het verlies van functionele myocardiaal weefsel en vervolgens een onvermogen van het hart om niet de metabolische behoeften van getroffen individuen voldoen. Aangezien het hart heeft een beperkte regeneratievermogen, autologe harttransplantatie is de enige huidige klinisch geaccepteerde therapie direct gericht op het aanvullen van verloren functioneel hartweefsel. Belangrijke nadelen van harttransplantatie, waaronder een beperkt aantal donorharten en de noodzaak van langdurige immunosuppressieve therapie, het wijdverbreide gebruik van deze therapie voorkomen. Dientengevolge heeft de medische therapie de steunpilaar van behandeling voor patiënten met hartziekte. Een belangrijke uitdaging in de ontwikkeling van geneesmiddelen is de identificatie van cellulaire assays die nauwkeurig normale en zieke myocard fysiologie vatten in vitro.
De recente convergentie van stamcel biologie en tissue engineering technologie roept nieuwe veelbelovende perspectieven voor cardiale regeneratie. Het genereren van functionele myocardweefsel uit een hernieuwbare patiënt-specifieke bron zou een belangrijke stap vooruit in het veld. Dit zou het mogelijk maken de ontwikkeling van de ziekte-specifieke cellulaire assays voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en ontdekking en zou de basis voor cardiale regeneratieve geneeskunde te leggen. Menselijke embryonale stamcellen (ES)-cellen en, nog belangrijker, de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een potentieel hernieuwbare patiënt-specifieke bron van ventriculaire progenitor cellen en volwassen ventriculaire myocyten. De combinatie van stamcelbiologie en tissue engineering strategieën lost dit probleem door het genereren van functionele hartweefsel in vitro kan worden gebruikt bij de ontwikkeling van cellulaire assays voor drug discovery of cardiale regeneratieve benaderingen voor de behandeling van hartfalen.
_content "> Een centrale uitdaging van de cardiale regeneratie is de identificatie van een optimale celtype. Een breed scala aan cellen zijn een bestudeerd, echter tot op heden, hoewel er verschillende multipotente cardiogene voorlopers uit verschillende bronnen zijn ontdekt, de identificatie van een cel bron die kritische eisen zoals betrokkenheid bij de myogene lot van de cel komt, is handhaving van het vermogen om in vivo of in vitro en samenstelling expanderen tot een functionele myocardweefsel bewezen een centraal probleem 2. We hebben eerder een dubbel transgene muizen beschreven waarmee de isolatie van sterk gezuiverde populaties betrokken ventriculaire voorlopers (CVP) uit ES-cellen differentiëren in vitro. We genereerden a novel dubbel transgene muis die de rode DsRed fluorescent eiwit tot expressie brengt onder de controle van een Isl1-afhankelijke enhancer van het gen en MEF2c het versterkt groen fluorescent eiwit onder de controle vande hart-specifieke enhancer Nkx2.5. Op basis van deze twee kleuren fluorescerende reporter systeem, eerste en tweede hart gebied voorlopercellen uit ontwikkelingslanden ES cellen kunnen worden geïsoleerd door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) volgens hun expressie van Nkx2.5 MEF2c en genen. CVP lijken hartmyocyten gebaseerd op de expressiepatronen van myocardiale markers en structurele en functionele eigenschappen 3, wat biedt veelbelovend voor hartweefsel regeneratieve doeleinden.Hoewel er veel vooruitgang op het gebied van tissue engineering, het nabootsen van inheemse cellulaire architectuur blijft een belangrijke uitdaging. Conventionele methoden om deze uitdaging zijn zaaien biologische of synthetische scaffolds met cellen in vitro. Door een aantal nadelen van steigers, waaronder een snelle afbraak beperkte fysische en mechanische stabiliteit en lage celdichtheid 1,4,5, hebben we geprobeerd scaffold-less weefselingenieur. Although hartcellen hun lokale micro wijzigen door de uitscheiding van extracellulaire matrix eiwitten, hebben een beperkte capaciteit om zich te organiseren om staafvormige hartmyocyten in afwezigheid van extracellulaire signalen. Aldus wordt een sjabloon dat cellen geschikte ruimtelijke en biologische aanwijzingen functioneel hartspierweefsel samenstellen biedt vereist. Microcontact afdrukken lost dit probleem op een eenvoudige en goedkope techniek om nauwkeurig celvorm, organisatie en functie 6-8, die allemaal essentieel voor het genereren van functionele lijn myocardium. Het omvat het gebruik van microtextured polydimethylsiloxaan (PDMS) stempels feature variërend tot 2 urn 9 dat de afzetting van extracellulaire matrix eiwitten toestaat op PDMS substraten in nauwkeurige patronen en aldus celadhesie ruimtelijk beïnvloeden.
Hierin stellen we voor om weefsel bio-ingenieur technologie te combineren met steel cell biologie tot anisotrope functionele myocardweefsel te genereren. Daarom tonen we hier onze onlangs benadering voor: (1) het genereren van micropatterned eiwitoppervlakken on PDMS substraten microcontact afdrukken voor het genereren van een sjabloon voor uitgelijnd myocardweefsel, (2) de isolatie van sterk gezuiverde cardiale voorlopercellen uit ES cellen differentiëren in vitro, en (3) de combinatie van beide technieken te genereren uitgelijnd functionele myocardium.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol stelden we een methode om gezuiverde populaties van cardiogene progenitors isoleren en om zaad ze op micropatterned Fibronectine substraten wat hen toelaat uitlijnen en neem een cardiale myocyten-achtige staafvorm. Normale cellulaire organisatie is essentieel voor normale weefselfunctie 8,10, in het bijzonder voor myocardium. Hartmyocyten is aangetoond dat verbeterde mechanische eigenschappen en elektrofysiologische 11,12 11,13 ontwikkelen bij het vormen anisotrope cel a…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd uitgevoerd in het kader van het Centrum voor Nanoscale Systems (CNS), een lid van het National Nanotechnology Infrastructure Network (NNIN), die door de National Science Foundation ondersteund onder NSF award niet. ECS-0335765. CNS is een onderdeel van de Universiteit van Harvard.
Materials
| Name of Material | Company | Catalogue Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4′,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
Riferimenti
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D., Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
